原代人软骨细胞培养,鉴定方法,传代形态变形原因

原代人软骨细胞简介

软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成，人软骨细胞就分离自软骨组织。软骨细胞位于软骨陷窝内。电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。

人软骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化制备而来，人软骨细胞分离自软骨组织;软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成。软骨组织再生能力强，这些增生的幼稚细胞形似纤维母细胞，以后逐渐变为软骨母细胞，并形成软骨基质，细胞被埋在软骨陷窝内而变为静止的软骨细胞。根据软骨组织内所含纤维成分的不同，可将软骨分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨三种，其中以透明软骨的分布较广，结构也较典型。软骨细胞(chondrocyte)位于软骨陷窝内。幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。成熟的软骨细胞多2-8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。体外培养的软骨细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

原代人软骨细胞培养方法

人软骨细胞培养实验准备

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：人原代软骨细胞专用培养基、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

原代人软骨细胞培养操作步骤

人软骨细胞复苏方法

将含有1 mL人软骨原代细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。

在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。

然后将所有原代人软骨细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜)。

第三天换液并检查人原代软骨细胞密度。

人软骨细胞传代方法

如果人软骨原代细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

加入0.25%Trypsin-0.02% EDTA消化液于培养瓶中(T25瓶1-2ml，T75瓶2-3ml)，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 -3min(难消化的细胞可以适当延长消化时间)，然后在显微镜下观察HC细胞消化情况，若HC细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加3-4ml完全培养基终止消化。

轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

将原代人软骨细胞悬液按1:2比例分到新的含6-8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

HC人软骨细胞冻存方法

待HC细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例;

a、收集HC细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据HC细胞数量加入无血清细胞冻存液，使人HC细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mLHC细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

HC人软骨细胞培养常见问题

HC人软骨细胞为什么传代后形态会发生变化?

软骨细胞传代后变形，可能是大多数老师在培养过程中都会遇到的问题。不过，传代时形态发生变化，这是正常现象。下面详解该细胞形态的变化过程：

第1代人软骨细胞，细胞形态呈梭形、多角形(仅供参考)

第2代的细胞形态

传了1代后，细胞形态开始发生改变，细胞伸出丝状伪足，形态似成纤维细胞(如图2)。

图2. 第2代细胞状态图(仅供参考)

从第1代到第2代，细胞就发生了形态上的改变。那么，继续传代下去，细胞形态是否会继续发生改变呢?

答案是肯定的。第3代的软骨细胞形态成纤维化会更为明显，细胞形态出现长梭形，并且生长速度开始下降。4代后较为明显，到第6代细胞形态几乎全部变为长梭形，似成纤维细胞样。所以，建议最好选择2代或3代的软骨细胞进行实验。

既然人软骨细胞传代时，形态会发生变化，那究竟是什么原因造成的呢?

在体外培养人软骨细胞时，软骨细胞呈贴壁生长，原代细胞大多呈椭圆形和多角形。随着传代次数增加，细胞逐渐变成长梭形，向纤维样细胞转化。同时，该细胞的功能也会发生变化：软骨标志性蛋白Ⅱ胶原合成分泌减少，而Ⅰ、Ⅲ型胶原合成分泌增多。

Ⅱ胶原的合成和分泌，是软骨细胞维持其分化表型的特征性指标，其在透明软骨中占胶原的85%~90%，提供了软骨特有的张力和硬度。

其次，软骨中的其他分子与胶原蛋白结合，会形成网状结构，使软骨具有一定的弹性，同时对于维持软骨形状，承载外来负荷起着非常重要的作用。所以，随着传代次数的增加，维持细胞形态的物质会逐渐减少，细胞的形态就会发生改变。

这种形态和功能的变化称之为反分化现象，也是单层传代细胞的普遍现象。

培养小贴士

1. 低密度培养的软骨细胞易发生去分化现象，一般最适接种密度为2~10×104/cm2;

2. 软骨细胞代谢较为缓慢，换液频度的增加无益于细胞的增殖，反而可能破坏由细胞分泌而形成的群体化学环境。

参考文献

[1] 魏钰, 魏民. 人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25):6.

[2] 张艳, 曹谊林. 人软骨细胞的体外培养[J]. 组织工程与重建外科杂志, 2005(5):4.

[3] 王勇平, 蒋垚. 软骨细胞体外培养及鉴定[J]. 生物骨科材料与临床研究, 2012, 9(4):3.

[4] 唐新, 郑果, 黄强,等. 人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析[J]. 实用骨科杂志, 2015, 21(7):5.

[5] Claus S , Aubert-Foucher E , Demoor M , et al. Chronic exposure of bone morphogenetic protein-2 favors chondrogenic expression in human articular chondrocytes amplified in monolayer cultures[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2010, 111(6).

原代人软骨细胞功能

软骨细胞具有合成和分泌基质与纤维的功能。

HC人软骨细胞文献溯源

1972年始，迄今为止，关于人软骨细胞(HC细胞)的文献已有2005篇。

在pubmed数据库中用“human chondrocyte cell line”搜索该关键词，第一篇为1972年M T Corvol在Endocrinology.发表的“A pituitary growth-promoting factor for articular chondrocytes in monolayer culture”。

HC人软骨细胞应用领域

人软骨细胞(HC)来源于正常的人关节软骨，它们产生并维持软骨的细胞外基质，包括II型胶原蛋白。在研究中，这些细胞是细胞重编程和分化的金标准对照。

针对HC的表型特征描述和观察其分化为破骨细胞。

研究使用HC来描述细胞受体的分子生物学、信号级联、细胞因子激活和基因调控。

HC涉及在炎症性疾病(如类风湿性关节炎、骨关节炎和莱姆病相关的关节炎)中看到的凋亡、细胞毒性和软骨降解。

通过检查剪切应力和机械转导途径的效果，一些研究人员希望利用HC开发出治疗侵蚀性关节病变的方法。

一些实验室利用HC研究单克隆抗体治疗或针对关节炎治疗的侵蚀性基质金属蛋白酶抑制剂的抑制。

因HC在潜在的临床应用中受到关注，因为HC能粘附在医疗植入物上并渗透到用于软骨再生的支架中。

细胞标志物

Collagen Type II和Aggrecan，以及Sox9。还有CD73、CD105、CD146、Collagen Type I、Osteopontin、MMP-13和C3等。这些标志物对于识别和研究软骨细胞非常重要。