UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞培养及应用领域介绍

UMNSAH/DF-1细胞介绍

UMNSAH/DF-1细胞是起源于10日龄的ELL-0鸡蛋的鸡细胞株，自发永生化。分离原代鸡胚成纤维细胞并在培养液中培养，传代直到衰老;在衰老过程中离心以保持细胞培养在30%到60%满;不衰老的克隆进行鉴定并传代不少于30次。在软琼脂上没有观察到克隆增殖，说明UMNSAH/DF-1细胞是永生化而没有转化。UMNSAH/DF-1细胞可作为病毒增殖、重组蛋白表达和重组病毒生产的基质。

UMNSAH/DF-1细胞产品信息

细胞名称：UMNSAH/DF-1，鸡胚胎成纤维细胞

细胞别称：UMNSAH-DF-1; UMNSAH-DF 1; UMNSAH-DF1; UMNSAH/DF#1; DF-1; DF1; Douglas Foster-1;鸡胚胎成纤维细胞;UMNSAH/DF-1

种属来源：鸡;10日龄

组织来源：胚胎，自发永生化

生长特性：贴壁生长

细胞形态：成纤维细胞样

致瘤性：No, in immunosuppressed mice. No, in semisolid medium.

保藏机构：ATCC; CRL-12203

培养基：DMEM+10%优质FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：38℃~40℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

UMNSAH/DF-1细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：DMEM基础培养基、优质FBS胎牛血清、双抗、胰酶、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

UMNSAH/DF-1细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLUMNSAH/DF-1细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀，移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀UMNSAH/DF-1细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

UMNSAH/DF-1细胞传代操作

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

4)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

5)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

6)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对UMNSAH/DF-1有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

7)将装有UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

8) 确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

UMNSAH/DF-1细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出UMNSAH/DF-1，在显微镜下观察UMNSAH/DF-1细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

UMNSAH/DF-1细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞培养小贴士

1. UMNSAH/DF-1细胞密度过高时会出现空泡，传代后状态可恢复；

2. DF-1细胞培养难度较高，温度波动会导致细胞空泡增多；

3. DF-1细胞为38℃~40℃培养，最佳培养温度为39℃，37℃培养会影响细胞状态，建议提前准备专用培养箱；

4. 受温度波动影响，收货常见细胞空泡较多，稳定培养后可恢复。

UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞培养常见问题

1.UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞收货后很多空泡?

这是因为UMNSAH/DF-1细胞在发货过程中，容易受到温度波动影响，而导致的细胞空泡增多。当细胞受到外界环境因素影响如温度时，细胞会发生内质网应激反应。细胞温度降低时，细胞膜上磷脂分子的运动减慢，流动性降低，从而降低了细胞膜对物质的通透性，钙离子内流，从而导致细胞质中色素堆积，空泡形成。

处理方法

将收到的细胞正常传代，观察空泡是是否有减少，若空泡仍有很多，可增加传代次数，一般正常传代后这种情况就会有所好转。

2.UMNSAH/DF-1鸡胚胎成纤维细胞培养注意事项?

细胞培养的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受到解刨部位体温差异的影响。对于不同的动物细胞，所需要的培养温度也有所不同，对于禽类动物细胞，最佳培养温度为39℃，所以UMNSAH/DF-1细胞的最佳培养温度也为39℃。37℃培养会影响细胞状态，建议提前准备专用培养箱。

若我们在培养细胞过程中出现了空泡，也有可能是细胞凋亡或是营养不够等原因，针对不同的情况需要采用不同的解决办法。在实验中，我们可以通过时刻关注细胞的状态，及时换液，采用优质血清，保证细胞所需营养充足等，避免空泡的出现。

鸡胚胎成纤维细胞文献溯源

2007年始，迄今为止，关于鸡胚胎成纤维细胞的文献已有5篇。

在pubmed数据库中用“UMNSAH/DF-1”搜索该关键词，第一篇为2007年Jiyoung Park在Mol Cell Endocrinol.发表的“Glucocorticoids modulate NF-kappaB-dependent gene expression by up-regulating FKBP51 expression in Newcastle disease virus-infected chickens”。

文献概述

FK506结合蛋白51(FKBP51，由FKBP5基因编码)是一个共伴蛋白分子，与伴侣蛋白HSP90和糖皮质激素受体(GR)在非活化的GR复合物中相互作用。FKBP51是糖皮质激素作用的负调节因子，当激素与GR结合时，它被FK506结合蛋白52(FKBP52，由FKBP4基因编码)取代，使GR复合物活化。

该研究发现，新城疫病毒(NDV)感染的鸡的12个器官中FKBP51 mRNA的表达被强烈诱导。相比非感染对照组的鸡，感染NDV的鸡的器官中皮质酮水平也升高了，大约是2倍至6.5倍。地塞米松处理重现了FKBP51 mRNA表达的诱导，表明糖皮质激素在全身诱导FKBP51 mRNA表达中起到了作用。

在鸡的UMNSAH/DF-1细胞中，核因子kappaB(NF-kappaB)以FKBP51依赖方式被激活。在UMNSAH/DF-1细胞中研究了三个NF-kappaB依赖的抗凋亡基因bcl-2，bcl-x和bfl-1 / A1的调节。地塞米松处理UMNSAH/DF-1细胞导致bcl-2的上调，bcl-x和bfl-1 / A1的下调。FKBP51的表达也导致bfl-1 / A1的下调，但对bcl-2和bcl-x无影响，这表明胰高血糖素-FKBP51-NF-kappaB信号通路参与了UMNSAH/DF-1细胞中bfl1/A1的表达调节。我们观察到在NDV感染和地塞米松处理的鸡的器官中，bcl-2，bcl-x和bfl-1/A1的表达显示器官特异性的上调或下调。NDV感染和地塞米松处理对bfl-1/A1，bcl-2和bcl-x的差异调控表明其他因素参与了这些基因的调节。这些结果表明，NDV感染的鸡中FKBP51的全身升高激活了NF-kappaB，该因子与其他因素合作以调节NF-kappaB依赖基因的表达。

UMNSAHDF-1鸡胚胎成纤维细胞应用领域

鸡胚胎成纤维细胞(UMNSAHDF-1) 是一种自发永生的鸡细胞系。该细胞可用作病毒增殖(新城疫病毒、流感病毒、马立克氏病病毒等)、重组蛋白表达(禽流感病毒H9N2等)和重组病毒生产的基质，因此该细胞在疫苗开发中具有重要作用。此外，UMNSAH/DF-1细胞系也可作为重组蛋白表达系统，用于生产用于疫苗、诊断试剂或治疗性蛋白的生物制品。

UMNSAH/DF-1 细胞系作为一种多功能和多用途的细胞模型，已被广泛应用于多个研究领域。同时，由于UMNSAH/DF-1细胞系来源于鸡，它们在评估药物对家禽的潜在毒性方面具有独特优势，可用于药物筛选和毒理学研究。

在细胞凋亡和信号传导研究中，UMNSAH/DF-1细胞系已被用于研究药物或病毒感染引起的细胞凋亡过程，以及相关的信号传导途径，如NotcH1细胞和Δ-like-1的表达。UMNSAH/DF-1细胞系也是进行基因克隆、基因编辑(如CRISPR/Cas9技术)和基因表达研究的良好模型。

DF-1细胞系还可用于评估生物材料的生物相容性，以及它们对细胞附着、增殖和分化的影响。此外，UMNSAH/DF-1细胞系在癌症研究、细胞衰老研究和神经生物学研究中也有广泛应用。