常见细胞污染类型如何辨别及预防解决方法

细胞污染是细胞培养中最常见、最棘手的问题，在发现细胞形态异常时，一定要及时排查污染并进行处理，否则会给我们的实验造成极大的影响。细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。

常见细胞污染类型如何辨别及预防解决方法

常见细胞污染类型

1. 真菌污染

污染来源：一般是来自实验服，并且具有气候性，多雨、气候湿润的季节容易出现。

污染培养细胞的真菌种类很多，常见的主要有：曲霉菌、黑曲霉、毛霉、白色念球菌、孢子菌、酵母菌等。

污染特征：真菌形态各异，但污染后均不难发现，真菌污染一般肉眼可见，肉眼下可观察到培养液中有淡黄色或是白色的点状漂浮物，短期内培养基一般不变混浊。倒置显微镜下可见细胞之间有絮状交错的菌丝或菌团，在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。细胞被污染后仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

呈链球状或丝状。常形成肉眼可见的菌落，培养基颜色无变化或变紫，仅对局部细胞影响较大，其他地方生长正常。会形成孢子，容易污染其他细胞。

1.2处理方法

真菌污染可以尝试使用两性霉素B进行处理，抑制真菌生长，在PBS润洗、换液后可加入两性霉素B(注意两性霉素B有细胞毒性，使用后可能会有副作用)，也可加入300μg/mL氟康唑培养，污染控制后改用150μg/mL培养2~3代。但真菌污染一般难以根除，若非必要，建议消杀后丢弃，对细胞房、培养箱、操作台以及器皿和培养液等进行全面消毒。

真菌污染可以尝试使用两性霉素B进行处理，抑制真菌生长。

1.3真菌预防

真菌污染属于微生物污染，预防主要从空气、器材、操作、血清入手。

a.减少空气流动，培养室和操作室要注意空气的消毒，工作时要戴口罩。

b.细胞培养器材消毒要彻底，尽可能的做到定期消毒，大概一周一次，若培养液漏出，则应立即消毒。

c. 实验操作应有无菌观念，动作要符合规范，不使用污染的器具，瓶盖应封紧。

d. 血清生产和使用时可能受到污染，在使用前最好先检查血清是否被污染，使用过程中也要保证不被污染。

2. 细菌污染

污染来源：操作不规范或无菌措施不到位等。

常见菌种：常见的细菌污染有大肠埃希菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等。细菌污染后，培养液在短期内会变黄色，因为有大量酸性物质产生，而且会发生浑浊。

污染特征：显微镜下可观察到大小不一(0.5～5μm)的物质，比细胞小很多，低倍镜下呈沙粒状布满细胞间隙或培养基，高倍镜下多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀，镜下观察有明显的定向运动；增殖速度快，一般污染后48~72h爆发式增殖；营养消耗快，培养基pH发生变化，颜色很快变黄，变浑浊，甚至可能有明显的异味；细胞生长缓慢，形态发生改变甚至脱落死亡。

2.1处理方法

轻度污染或细胞比较珍贵：可用10～20×双抗清洗处理。吸出培养基，以PBS清洗2～3遍，加胰酶消化至细胞形态略有变化但未脱离容器底部，加PBS轻轻润洗1次后加入20×高浓度双抗浸泡细胞3～5min，弃双抗；加入含10×双抗的无污染完全培养基正常培养12h后正常传代，并仍以含10×双抗的完培进行培养，若第二代镜下未观察到细菌，第三代则可用正常培养基培养，传代48h后无反弹认为污染已清除。

重度污染建议直接消杀丢弃后对培养箱进行彻底消毒。为预防细菌感染，建议日常培养基中正常添加双抗。

细菌污染后大多能改变培养液 pH 培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

处理方法：轻度污染可用10X双抗清洗处理，重度污染建议消杀后丢弃

3. 支原体污染

支原体污染：支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁的原核生物，大小约 0.3 - 0.8 微米。目前，已发现的支原体品种有 100 多种。 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的 0.20 微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过 0.10 微米孔径的除菌滤膜，造成细胞的支原体污染。在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到 63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞(特别是传代细胞)被支原体污染后，细胞内的 DNA、RNA 及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。

污染来源：血清、胰酶、已污染物的气溶胶、操作人员的口腔及皮肤等。

常见种类：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体等。直径约为 0.1～0.3 μm，具有变形能力，可通过过滤膜(0.22-0.45 μm)。

污染特征：最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。细胞增殖减慢，镜下观察碎点变多、细胞边界变得模糊、形态异常(拉丝、铺展)、胞浆出现小颗粒或空泡，状态越来越差；培养条件未变，培养基清澈；更换新的培养液，细胞状态没有恢复。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

3.1支原体鉴定方法

鉴定方法：分离培养法、PCR法、ELISA、DNA荧光染色法、电镜等。

支原体是一类缺乏细胞壁的细胞，呈高度多形性，细胞培养中被支原体污染是比较常见的问题，因为污染来源太多，包括工作环境、操作者、血清、实验器材等，鉴定的方法如下。

a. 相差显微镜观察。其中可以采用直接观察或地衣红染色观察，直接观察时，位于细胞表面和细胞之间的暗色微小颗粒为支原体，但要与线粒体区分。

b. 荧光染色法。将细胞接种于盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不含酚红的Hank's液漂洗后，再用1:3醋酸甲醇固定10min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配制的 Hoechst 33258(浓度为50ul/ml)中染色10min，荧光染料将支原体内的DNA着色，染色后用蒸馏水洗1~2min，滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下散于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点为支原体。

c. 电镜检查。制备电镜标本，用扫描电镜或透射电镜观察。

d. DNA分子杂交检查。按试剂盒说明进行，检出率高，但方法较复杂。

e. PCR。现有支原体PCR检测试剂盒销售，可按说明书检测支原体污染。

3.2处理建议

支原体污染十分麻烦，若细胞已受支原体污染，最佳的处理方式是将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株，培养箱的其他细胞可用支原体抑制培养基培养1～2代，以作预防，并使用支原体环境消毒试剂进行环境消毒。

对于珍稀细胞

1)采用支原体抑制试剂处理细胞，根据相关指南使用，周期结束后可以进行鉴定。

2)清洗纯化法，由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使潜在支原体数量降低至极限，并结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到较好的效果，但极有可能无法根除;

3)支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可抑制支原体生长，一般抗血清处理后11天即可转为阴性。

4)巨噬细胞吞噬法：将巨噬细胞与被支原体污染细胞共培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体被消除干净为止。

5)使用支原体抗体培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌PBS洗涤细胞1~2次，保持适当细胞密度;处理15天后，用支原体检测试剂盒检测支原体是否完全清除;

6)为避免细胞再次受到支原体污染，应每隔1月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

处理方法：若细胞状态尚可，添加支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

4. 黑胶虫污染

污染来源：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

“黑胶虫”是一种常见的细胞污染物，暂无明确定义，可存在于动物细胞，也可以生存于培养基中，随细胞传代而传代，是一种异养物质，主要来源为血清。

4.1污染特征

培养液不浑浊，但在显微镜下观察细胞时，细胞周围和培养液中有很多“小黑点”，且“黑胶虫”与细胞数量呈负相关，随着细培养时间的延长“小黑点”逐渐增多，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除;ⵘ

细胞营养消耗快，需要频繁更换培养液;

细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能出现细胞形态的改变。

“黑胶虫”与细胞竞争性生长，严重时导致细胞死亡。

4.2处理方式

对于黑胶虫污染的细胞，最快速有效的处理方式是使用黑胶虫清除剂，添加黑胶虫抑制剂/支原体抑制剂培养2-3代可转阴，同时确保培养体系中的血清必须为无黑胶虫污染的优质血清。非珍稀或污染严重细胞建议直接丢弃。

另外对培养箱做由里至外的清洁处理;

4.3预防措施

实验进行前，超净台用紫外灯照射30-60min，然后用75%酒精擦拭超净台台面，并开启超净台风机运转5-10min再开始实验操作；

实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内;实验用品用完应移出超净台，以利于空气的流通;实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面；

每次操作只处理一种细胞，即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染；

操作时小心取用无菌的物品，避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换;不要在打开的容器瓶口正上方操作，容器打开后，倾斜45°操作，操作完成后及时盖上瓶盖；

CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。

先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射4h以上。水盘内加入无菌水(应每周更换)，待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞；

定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。

5.细胞交叉污染

特征：即不同的细胞混杂在一起

污染来源：细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会出现细胞交叉污染。目前，已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

鉴定方式：同种属进行STR鉴定，多等位基因数大于3个。(需考虑本身的遗传背景，如EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息)；不同种属进行PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

处理建议：建议重新引种。

预防建议：尽量避免多细胞同时操作，如传代等;器具和培养溶液避免交叉使用。

污染防治策略

NO.1 细胞房环境控制

环境要求：洁净区10000级，局部100级，定期进行沉降菌检测

环境消毒：每周一次定期消毒灭菌

a.地面/墙面：84消毒液、新洁尔灭交叉使用

b.环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸

c.仪器设备表面：75%酒精擦拭，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂

d.耗材消毒：需重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用

NO.2 实验人员管理

着装：着连体衣，戴口罩、手套，头发、手腕等要包好，减少皮肤外露。

行为：减少走动，出入关门，操作时不要讲话。

技能:养成良好的无菌操作习惯。

其他：减少共用物品，公共使用区域统一使用习惯，区分洁净区域和有风险的区域。

细胞房规范操作流程

1)进入细胞房前穿戴实验服、口罩、手套及鞋套等，用消毒酒精擦拭双手;

2)实验前准备：提前0.5～1h打开超净台紫外灯进行消毒，同时将足量所需试剂、耗材等放置于消毒窗口，打开紫外灯进行消毒。

3)按照个人习惯摆放试剂、耗材及仪器，切勿置于生物安全柜进出风口;

4)操作要准确、敏捷、有序，尽量减少试剂和细胞瓶的敞口时间;专管专用，避免交叉污染;

5)操作完成后，将试剂放回原位;丢弃废物和废液;用酒精擦拭台面进行消毒;打开超净台及细胞房紫外灯，至少照射15min进行消毒。

6)定期清理建议

NO.3 实验用品管理

试剂：使用前确保无菌，自己配制的试剂需过滤除菌后再使用。

耗材：需要重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用。

仪器设备：定期擦拭消毒，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂。

其他：当出现培养物泄漏时，应及时清理干净;出现局部污染时，应找出污染源并对环境整体消毒。

细胞污染类型常见问题

1.如何判断小黑点是污染还是碎片

细胞碎片或者分泌物

在细胞代谢过程中，细胞凋亡后会产生一些分泌物的沉积和碎片物质，在显微镜下呈黑点状。

特征

细胞碎片大小不均一，会随着培养时间少量增多，但是不会呈倍增的趋势增多;

细胞状态差时碎片会较多，状态变好后黑点减少;

细胞分泌物情况根据细胞有区别，有的细胞不产生分泌物，有的细胞会有较多的分泌物，往往是不影响细胞形态和增殖速度。

外源微生物污染

当细胞被支原体、黑胶虫或者细菌污染时，往往也会产生很多小黑点，尤其是细菌污染的情况出现时，这些小黑点甚至会导致培养液浑浊。

如何区分是否为污染

外源微生物污染

支原体和黑胶虫污染一般表现为黑点增多并伴随细胞生长速度变慢、死细胞增多等现象，通常加入对应清除试剂后细胞状态会有显著改善。

细胞分泌物/细胞碎片

细胞分泌物和细胞碎片则不会因为加入清除试剂后而改善，会持续存在且不影响细胞增长。

细胞污染后的处置

细胞一旦发现有污染出现，应及时对所用试剂和耗材进行清理。耗材可更换新的或者重新高压灭菌，试剂可重新过滤除菌或者更换新批次，操作台和细胞房需用消毒液进行全面清洁消杀后方可复苏新的细胞，以免反复出现污染。

2.在细胞培养液中，有种可以游动的虫子是什么污染?

是细菌污染。带鞭毛的细菌就是会游动的。

3.有很多黑点，在原位颤抖，没那么明显的定向运动，是什么污染?

细胞碎片、血清沉淀和有些细菌污染，都会在原位颤抖。前者是原地做不规律的布朗运动，细菌是原地转动，频率会高很多。

4.血清的絮状物杂质属于正常现象吗?

血清里面有一些大分子蛋白和一些纤维析出，呈现絮状，也有一些磷酸钙析出呈现小黑点，这些都是很常见的。沉淀太多，可以离心去掉部分。血清沉淀的多少也跟血清的溶解方式有关，溶解过程中最好是4℃，期间不时摇晃进行溶解。根据普诺赛多年培养细胞经验，血清的沉淀多与少并不决定血清质量。

5.液体变微黄、浑浊怎么解决?

这个是典型的细菌污染。如果细胞形态尚且完整，可以尝试用10%的双抗清洗去除，或者使用别的抗生素清除，如庆大霉素50U/mL、四环素10μg/mL等;如果细胞状态已经很差，就没有挽救的价值了。

6.为什么有的培养基天天需要换液呢?

正常情况下，是不需要每天换液的。培养基橘黄色是细胞比较喜欢的环境，正常是2~3天换一次比较好，换液多了细胞状态反而容易受影响。如果是因为培养基异常消耗，才需要每天换液，那么我们要做的是找到异常消耗的原因，是细胞量过多，还是有其他细菌或者支原体污染。先找到原因才能不用每天换液。

7.冻存的细胞，每次复苏养几天就污染了，是什么原因呢?

如果冻存前就带进去了污染，那么同一批次的复苏出来都会有污染。这种情况下，可以在复苏当天给予抗生素清除(不能用双抗)，如庆大霉素50U/mL、四环素10μg/mL等;如果同一批有复苏没有污染的情况，要考虑复苏过程，建议换一下水浴锅的水和其他试剂耗材再复苏。

8.细胞培养不生长，传代扩不起来，是不是就是支原体污染?

支原体污染肉眼是很难区分的，支原体污染会导致细胞状态变差，但是细胞状态变差并不是都是支原体造成的，所以我们还是要用支原体检测加以区分。

9.培养基污染以后，可以过滤一下继续使用吗?

不建议继续使用。培养基里面可能会有残留的细菌分泌物，比如内毒素等，可能会影响细胞生长。

10.培养箱水盘用什么抑菌剂?

传统方法用硫酸铜，但是硫酸铜属于重金属，还是有一定的毒性的。建议使用水浴锅安全卫士，安全无毒，可以持续一周无菌状态。

11.试剂已经全部换新的了，还是一直污染，是什么原因?

如果试剂盒耗材全部更换了，还需要排除下冻存前是否有污染。再就是是否存在操作问题，可考虑换其他人养一下试试。

12.悬浮细胞碎片形成的黄团怎么处理呢?

悬浮细胞碎片形成的黄团可以通过低速离心去除，前提是细胞量一定要够多，转速一般可以降低到800rpm左右。离心完上清别急着丢，先看下细胞是否已经离心下来，也可以根据细胞大小调节离心转速。

13.细胞里面有一些小方块一样的东西，是什么原因?

小方块一般是结晶类的。可以先用培养基或者PBS稀释溶解后换液，看有没有改善。

14.放了五个月的完全培养基，出现絮状悬浮物，但是观察不是细菌，可以过滤后加点血清继续使用吗?

不建议继续使用。絮状物首先要排除霉菌类的污染；即使排除了霉菌，完培产生絮状物析出了，也会对成分有一定的影响，影响后期培养细胞。

15.饲养杂交瘤细胞，如果观察有没有污染，大概要在多大倍镜下观看?

观察污染的话400倍镜就够了，10X目镜加40X物镜。

16.请问贴壁细胞表面有白膜，培养液恶臭，是什么原因导致的污染?

有白膜和恶臭应该是有污染无疑了，还很严重，具体是细菌还是真菌，要结合显微镜下的菌体形态来进一步区分。

17.细胞污染后，用10倍双抗处理后，没有再长，这时细胞可以冻存吗?

细菌不再生长，恢复正常1%抗生素后一周内没有再长起来，就是清除干净了，可以冻存。

18.孵箱中一瓶细胞有黑胶虫污染，慢慢地整个孵箱都有污染了，那孵箱怎么打扫?

把细胞全部转移走，再用消毒液把培养箱全部擦拭一遍；培养箱水一定要清理干净；培养箱角落和表面都喷上细胞房卫士，关闭培养箱保持30分钟，再打开散气30分钟，换上干净的无菌水就行了。

19.请问培养箱灭菌水多久换一次呢?换的时候每次都要90℃灭菌么?

水浴锅的灭菌水不加抑菌剂的话，建议是每次复苏前都更换新的；加了水浴锅安全卫士，可以一周换一次，水是121℃灭菌20分钟。

20.液氮有没有可能污染?

理论上液氮这种极端的环境里，是不会有生物存活的，细菌冻存也是需要保护剂的。

21.新复苏的细胞，一天后正常贴壁，但是培养液里悬浮大量的黑色团块，是什么原因呢?

可能是有细菌污染了，还是要结合显微镜下的黑团形态来进一步确诊。

为了防止发生污染，预防是第一位的，而且要注意实验规范，尽量做到定期消毒，实验人员也要有防止污染发生的意识，遇到发生污染情况可运用上述的鉴定和去除方法，不过一切的去除方法都不如一个众所周知的习惯——保存无污染的细胞株，这才是最明智的做法。

规范操作是避免污染的最有效方式。细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，并定期消毒。专用物品只在培养间内使用，不得带出细胞房。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。必要物品可暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流的通畅。培养细胞过程中使用的所有实验用具，如移液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等需121°C高压灭菌20分钟后烤干备用，一些玻璃器皿如细胞培养瓶等须先泡酸、洗净、晾干后再高压灭菌。