MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导实验步骤

MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导引言

MC3T3-E1subclone 14细胞株是从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆。 从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。 MC3T3亚克隆4(ATCC CRL-2593)和MC3T3亚克隆14(ATCC CRL-2594)在抗坏血酸和3到4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化。 它们10天后形成一个矿化良好的细胞外基质(ECM)。

MC3T3亚克隆24(ATCC CRL-2595)和MC3T3亚克隆30(ATCC CRL-2596)在抗坏血酸中生长表现出很差的成骨细胞分化。 不形成ECM， 可以作为亚克隆4和14的阴性对照。 矿化的亚克隆选择的表达作为成骨细胞标记的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨钙素(OCN)，和甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体的mRNA。

高或者低的分化潜能的亚克隆在培养中生产出相似数量的胶原质，表达可比较的基本水平的mRNA编码Osf2/Cbfa1，一种成骨细胞相关转录因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亚克隆形成与骨类似的形成小骨的编织骨，低分化细胞只是产生纤维组织。 这些细胞系是研究体外成骨细胞分化的好模型，尤其是ECM信号。 它们和原代培养颅顶成骨细胞的行为类似。

MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导分化实验步骤

实验准备

MC3T3-E1 Subclone 14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14细胞

MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导分化实验步骤(以12孔板为例)

1.MC3T3-E1 Subclone 14细胞正常培养，细胞融合度达到80%~90%时，即可用胰酶消化，计数;；

2.按2~3×104 cells/cm2的细胞密度接种在12孔板中(具体接板数量以实际预实验情况为准)，每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14细胞完全培养基；

3.将接种好的MC3T3-E1 Subclone 14细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养；

4.诱导试剂配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨诱导分化培养基由基础培养基、血清和添加物三部分组成，使用前将各组分混匀后即可得到成骨诱导分化完全培养基；

5.当细胞融合度达到80%~95%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向12孔板中加入1 mL预热的MC3T3-E1 Subclone 14成骨诱导分化完全培养基；

6.每隔48~72h更换预热的新鲜的成骨诱导分化完全培养基；

7.诱导培养2~4周，期间注意观察细胞形态变化。根据细胞钙质结节形成的情况，决定是否进行下一步染色鉴定。

MC3T3-E1 Subclone 14细胞诱导分化结果展示

MC3T3-E1 Subclone 14诱导过程中注意事项

开始诱导时的细胞密度可控制在90%~95%，注意避免细胞过饱和导致细胞卷边漂起或者状态不佳。

实验开始前确保细胞状态，尽可能使用早代次的细胞开始实验。

细胞铺板需均匀，铺板不均匀可能导致分化不均匀、分化比例低、分化过程中细胞漂浮等问题。

由于诱导时间较长，为防止细胞脱落，可提前使用明胶包被培养板。

细胞换液或者添加诱导分化培养基时需注意：诱导分化培养基提前37℃复温；换液时可留一点原液作为缓冲，加液时枪头沿壁逐滴加入，操作应迅速，尽量避免在超净台内操作时间过长，同时手法要轻柔;这样对细胞的冲击最小，否则极易导致细胞卷边飘起。

避免长时间将细胞拿出培养箱外进行观察，并尽量减少培养板的晃动，以防细胞卷边或漂浮。

拍照时可留少量PBS，减少光圈的出现，以便呈现更好的拍摄效果。