细胞爬片固定实验步骤及注意事项

爬片是一种将细胞培养在玻璃或塑料表面上，使其附着并扩展的技术。一般是让玻片浸在细胞培养基内，使细胞在玻片上生长。这种技术可以用于观察细胞形态、运动、细胞与细胞之间相互作用等。利用细胞爬片进行体外实验可排除体内诸多干扰因素的影响，方便对细胞进行各种干预处理。

在做免疫荧光(IF)，激光共聚焦(Confocal)，凋亡检测(TUNEL)时，免不了要制备细胞爬片，爬片质量决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。今日为大家整理了细胞进行爬片固定制作步骤及注意事项，帮助您快速上手开展实验。

细胞爬片固定实验步骤及注意事项

细胞爬片准备

1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；

2.将盖玻片剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪时用小沙轮轻划一下，稍用力掰开。如接种大皿，请不要将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，待染色时再切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做多个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，次日用自来水冲20遍，置于无水j精中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍(主要目的是将酸冲洗干净，以免影响细胞贴壁效果)，置于玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压消毒后取出放入烤箱中烤干，放入超净台备用。

细胞爬片制作

1.胰酶消化细胞后，计数重悬细胞于完全培养基中。

2.根据玻片的大小加入细胞，向每孔中预留的放置爬片的位置处滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿粘合到一起，然后放入玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

3.根据需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

4.待细胞贴壁后，去上清，加含药培养基。

5.按照实验设计，一段时间后取出玻片。取玻片时，将注射器针尖向背面弯曲，将爬片轻轻勾起，用小镊子取出。

6.将所需数量的爬片取出时，应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可继续培养。

细胞爬片固定

1.细胞爬片取出后，用PBS洗2遍再做固定(此步骤可根据研究目的做取舍，比如做凋亡细胞染色时可免洗，凋亡的细胞在清洗的过程中有可能脱落)。

2.用培养皿保存细胞爬片。在皿底放一层面巾纸，再放爬片，(方便取片)。然后盖上盖子，做好标记，用透明胶带将盖子和皿连在一起，-20℃保存。

3.放-20℃保存之前，吸干培养基或PBS，-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

细胞爬片常用的固定液

1.冷丙酮：可用于一般的免疫组化染色。

将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心，丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发)固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胞分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

室温固定15分钟后，将表面液体吹干，-20℃保存

3. 95%乙醇，可用于免疫组化。

优点：穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间胶长，抗原会流失而减弱反应强度。

室温固定15分钟后，将表面液体吹干，-20℃保存

4. 甲醛(福尔马林)

优点：形态结构保存好，且穿透性强，

缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

以多聚甲醛为例进行固定

1.准备4%多聚甲醛(PFA)，于4℃冰箱中保存，使用时常温复温。

2.在培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。

3.用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(细胞自带荧光时注意避光)，PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

4.Triton X-100(PBS配制，浓度根据实验调整)室温通透20 min。

5.PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

6.按实验需求进行后续实验。

细胞爬片封片

封片前根据实验需求决定是否需要孵育抗体或复染核。孵育好后用PBS浸洗3次，用吸水纸吸干爬片上的液体，封片液封片。

细胞爬片注意事项

固定好的细胞爬片建议尽快用于实验，以免影响实验效果。

取爬片时注意控制力度，夹取时尽量夹取爬片边缘，以免夹破爬片或造成划痕。

细胞爬片取出后，一般用PBS润洗3遍(润洗操作尽量轻柔，以免细胞脱壁;根据研究目的，可调整润洗次数，避免细胞脱壁)，然后做固定。

对于贴壁性较差的细胞，可提前用包被液(明胶，多聚赖氨酸，鼠尾胶原等)包被爬片。

如果细胞带有荧光标记，所有操作步骤尽量在较暗处进行。

使用细胞爬片时(比如在六孔板中放入爬片，六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分，加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底，有时细胞生长边集现象，就是靠近壁边缘密度要高些，这样处于中央玻片上爬的细胞数量就可能相对较少)。比较好的做法是将玻片放入孔板的孔内后，加细胞悬液时只滴到玻片上，一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘。

按照实验设计，作用一定时间后取玻片。注意细胞不能太密，否则容易掉片。