细胞免疫荧光原理,实验步骤,应用和常见问题

免疫荧光(immunofluorescence technic)Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。

细胞免疫荧光原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体(第二抗体)与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免役荧光准备实验材料

1.抗体：根据需要使用的抗體，可以选择合适的抗體。

2.细胞：根据实验需要，选择合适的细胞进行实验，并在37℃5%C02的培养箱条件下保持培养，直到实验需要。

3.用于洗涤细胞的生理盐水或PBS缓冲液：使用无菌的生理盐水或PBS缓冲液洗涤细胞，可以保护细胞免受外界环境影响。

4.收集细胞：如酶标记或其他标记，获得细胞膜丰度，收集细胞进行数目统计，以确定最终实验细胞数量。

5.荧光染料：根据需要，选择合适的荧光染料，按指定的比例混合，配制成荧光染料溶液备用。

细胞免役荧光固定和渗透化处理

1.使用适当的缓冲液(如甲醛)或有机溶剂(如甲醇)将细胞/组织进行固定处理。

2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。

3.固定后，用洗涤缓冲液(如PBS)洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。

4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。

细胞免役荧光抗体染色

1.准备合适的一抗和二抗。一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。

2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。

3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。

4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。

5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。

6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。

细胞免役荧光显微镜观察

1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。

2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。

3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。

细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋

白质在细胞内的空间分布和功能的信息。不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根

据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。

细胞免役荧光技术应用

检测靶蛋白如内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物。

细胞免役荧光常见问题

1.怎样选择二抗标记的荧光

A: 二抗标记的荧光颜色的选择非常重要，要求在实验前根据现有材料和仪器的局限性设计好实验方案，一般我们进行三种颜色的标记工作。目前细胞核染料常用PI(红色)或DAPI(蓝色)，如果细胞中还表达EGFP(绿色)，则需要选用其他颜色的荧光素来标记目的蛋白，不得已的情况下采用颜色相近，后期也要用光谱拆分技术对图片进行处理(需专业人员进行，不建议采用相近颜色)。

2.怎样选择细胞免疫化学爬片所用的固定剂?

用甲醇，强烈脱水变性蛋白，并可溶解脂类物质产生通透效应;蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原，无需通透处理不易保存细胞形态，细胞可能呈扁平状。

细胞结构抗原、酶类抗原交联剂用多聚甲醛，导致细胞内分子相互连接呈网状结构，并维持在原位上，更易于保持细胞的结构交联产生的阻碍可能会降低细胞组分的抗原性，需要通透处理细胞膜相关组分蛋白。

3.做细胞免疫荧光大概提供多少抗体合适?

A：细胞免疫荧光实验我们需先进行预实验采用普通荧光显微镜进行观察，确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。24孔板的细胞爬片在进行一抗37℃孵育时，一般加入200ul经BSA稀释的一抗，其稀释倍数需参考抗体说明书，如稀释倍数为1：100则每张爬片需要2ul(进行细胞免疫荧光的一抗稀释倍数要比WB的小)。注意提供的抗体量需满足预实验和正式实验所需的量。

4.激光共聚胶显微镜拍摄除用于细胞免疫荧光拍摄外还可以进行哪些检测?

A：由于各种荧光标记探针的应用，通过对荧光探针分布和荧光强度的分析，Confocal实验还可以用于进行细胞内游离钙、线粒体膜电位、活性氧、细胞膜流动性、细胞结构等实验结果的拍摄和分析工作。根据客户对细胞处理的要求并且购买合适的探针试剂盒，我们也可以为您进行您实验所需的Confocal拍摄工作。