一种源自青蛙皮肤的肽通过抑制STING介导的炎症，靶向SCD1，对皮肤损伤具有放射防护作用

基本信息

英文标题：A Frog Skin-Derived Peptide Targeting SCD1 Exerts Radioprotective Effects Against Skin Injury by Inhibiting STING-Mediated Inflammation

中文标题：一种源自青蛙皮肤的肽通过抑制STING介导的炎症，靶向SCD1，对皮肤损伤具有放射防护作用

发表期刊：《ADVANCED SCIENCE》

影响因子：14.3

作者单位：

四川大学华西第二医院的辐射医学实验室;

第四军医大学预防医学研究所放射医学科;

苏州大学放射医学与防护学院国家重点实验室

作者信息：

Fenghao Geng, Li Zhong, Tingyi Yang, Jianhui Chen, Ping Yang, Fengdi Jiang, Tao Yan,Bin Song, Zuxiang Yu, Daojiang Yu, Jie Zhang,* Jianping Cao,* and Shuyu Zhang*

研究背景

背景：辐射性皮肤损伤缺乏有效防治手段，STING通路激活是关键致病机制。

生物启发：耐辐射生物(如奇球菌、缓步动物、蛙类)通过抗氧化、DNA修复或多肽分泌抵抗辐射损伤。

新发现：蛙源多肽RIFSP-2通过抑制SCD1减少单不饱和脂肪酸生成，阻断STING过度激活。

机制：RIFSP-2调控脂代谢-免疫轴(SCD1-STING-MUFA)维持细胞稳态，减轻辐射皮肤损伤。

意义：提出靶向天然多肽调控代谢-免疫平衡的抗辐射新策略，为临床转化提供候选分子。

研究方法

细胞培养与辐射处理

细胞来源及类型：HaCaT、WS1、HEKs、RAW 264.7。

培养基及条件：HEKs用D-KSFM，其他用含10% FBS的DMEM，37℃、5% CO₂。

辐射设备与方法：KUBTEC XCELL 320，不同剂量，1.7 Gy/分钟。

青蛙处理与辐射模型

动物来源：成年黑斑侧褶蛙，体重20–25 g。

辐射方法： Clinac 2100EX加速器，6-MeV电子束，剂量率1000 cGy/分钟。

伦理审批：苏州大学动物实验伦理委员会。

RIFSPs多肽合成与标记

合成与纯化：上海生工生物工程，HPLC和LCMS验证纯度≥95%。

小鼠模型与处理

基因敲除小鼠：TMEM173-KO和杂合，通过CRISPR/Cas9技术构建。

实验模型：全身辐射4 Gy，皮肤损伤模型(直径8 mm创口)。

伦理审批：苏州大学动物实验伦理委员会。

多组学研究

RNA测序：上海欧易生物完成。

多肽互作组分析：杭州景杰生物完成。

脂质组学：苏州帕诺米克生物完成。

免疫共沉淀(IP)实验

细胞裂解：预冷PBS清洗，

裂解液裂解。IP：500 μg裂解液，3 μg STING抗体与Protein G磁珠。

检测：Western blot。

生物素-链霉亲和素互作组研究

处理：细胞加15 μM生物素标记肽，裂解。

分析：500 μg裂解液与链霉亲和素磁珠结合。

表面等离子体共振(SPR)分析

蛋白固定：CM5芯片，胺偶联法。

结合动力学：RIFSP-2浓度梯度，HBS-EP+缓冲液。

参数计算：Biacore T200软件。

实验结果

A. 辐射损伤模型建立

示意图展示了在青蛙背部和四肢建立辐射诱导的皮肤损伤模型。

B. 生存曲线分析

绘制了不同剂量辐射暴露在背部青蛙的生存曲线。

C. 皮肤组织形态变化检测

使用H&E染色检测辐射后青蛙背部皮肤组织的形态变化。

D. 四肢皮肤病理表现

观察了不同剂量辐射暴露在四肢皮肤组织中的病理表现。

F. 皮肤组织粗提物研究

示意图展示了使用UV-VIS光谱法对皮肤组织粗提物进行研究，以及进行RNA-Seq和肽组分析的工作流程。

G. 光学密度变化

记录了辐射青蛙皮肤组织粗提物的光学密度变化。

H. 基因表达火山图

显示了辐射后青蛙皮肤组织中不同表达基因的火山图。

I. 基因聚类分析

进行了辐射诱导的不同表达基因的聚类分析。

J. 基因本体论(GO)分析

对辐射诱导的不同表达基因进行了GO分析。

K. 京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析

对辐射诱导的不同表达基因进行了KEGG分析。

L. 肽表达火山图

显示了辐射后青蛙皮肤组织中不同表达肽的火山图。

M. 肽聚类分析

进行了不同表达肽的聚类分析。

N. 皮肤损伤后照片

提供了使用不同RIFSPs处理的联合皮肤损伤模型小鼠在皮肤损伤后的照片。

O. 创伤愈合照片

提供了使用不同RIFSPs处理的联合皮肤损伤模型小鼠在创伤愈合过程中的照片。

P. 显著性差异

标记了与对照组相比具有显著性差异的结果，*P < 0.05 和 **P < 0.01。

1. RIFSP-2摄取机制

A) FITC标记显示RIFSP-2为膜不通透性，需通过胞吞作用进入HaCaT细胞。

B) 流式细胞术证实细胞对FITC-RIFSP-2的摄取呈时间和剂量依赖性。

C) 肝素(竞争性抑制剂)、阿米洛利(巨胞饮抑制剂)和细胞松弛素D(胞吞阻断剂)显著抑制摄取，提示RIFSP-2通过巨胞饮途径内化。

2. RIFSP-2对细胞增殖与衰老的影响

D) 集落形成试验表明RIFSP-2可促进辐照后皮肤细胞增殖(*P <0.05)。

E) PI染色显示RIFSP-2调控细胞周期，减少辐照诱导的G2/M期阻滞。

F-G) SA-β-Gal染色表明RIFSP-2显著降低辐照导致的细胞衰老(**P <0.01)。

3. 线粒体功能保护作用

H) 共定位分析显示RIFSP-2在辐照细胞中线粒体富集。

I-J) DCFH-DA和MitoSox染色证实RIFSP-2抑制辐照诱导的细胞内及线粒体ROS积累(** P <0.01)。

K-L) ADP探针和JC-1染色表明RIFSP-2维持能量代谢和线粒体膜电位，减轻辐照损伤。

4. 肌动蛋白稳态与细胞死亡调控

M) 罗丹明鬼笔环肽染色显示RIFSP-2保护辐照细胞的肌动蛋白丝完整性。

N) 抑制肌动蛋白聚合(细胞松弛素B)或促进解聚(5αP)会逆转RIFSP-2的抗凋亡效应(AV/PI染色验证)。

O-P) 钙黄绿素AM释放试验表明RIFSP-2减少辐照引起的溶酶体膜透化及细胞坏死(**P <0.01)。

1. RIFSP-2互作组分析

A) 基于生物素-亲和素系统的LC-MS/MS互作组学揭示RIFSP-2在辐射皮肤细胞中的结合蛋白。

B) 韦恩图显示RIFSP-2特异性结合的蛋白质谱，SCD1(硬脂酰辅酶A去饱和酶1)被鉴定为关键互作靶点。

C) GO分子功能富集分析表明RIFSP-2互作组显著参与脂质代谢相关通路(如脂肪酸去饱和酶活性)。

2. RIFSP-2与SCD1的直接作用验证

D) 共定位分析显示FITC-RIFSP-2(绿色)与内质网标记(ER-Tracker，红色)高度重合，提示其靶向脂质代谢关键细胞器。

E) BODIPY 493/503探针染色显示RIFSP-2显著抑制辐射诱导的中性脂滴积累(**P <0.01)。

F) 免疫沉淀实验证实RIFSP-2与SCD1直接结合。

G) 分子模拟揭示RIFSP-2通过特定氨基酸残基(如Arg/Lys)与SCD1活性口袋结合，可能抑制其功能。

3. RIFSP-2对脂质代谢的调控

H) 脂质组学分析示意图显示RIFSP-2预处理逆转辐射引起的脂质代谢紊乱。

I-J) 热图和箱线图表明辐射显著上调单不饱和脂肪酸(如油酸、棕榈油酸)，而RIFSP-2抑制这一效应(** P <0.01)。

K) 饼图显示RIFSP-2处理组中单不饱和脂肪酸比例降低，多不饱和脂肪酸比例升高。

L) 功能富集分析证实RIFSP-2选择性抑制SCD1介导的脂肪酸去饱和代谢通路。

4. SCD1介导的辐射损伤机制验证

M-N) SCD1抑制剂MF438消除RIFSP-2对中性脂滴形成的抑制作用，并逆转其对铁死亡(BODIPY 581/591 C11探针染色)和凋亡(AV/PI染色)的保护效应。

O-P) 统计显示MF438处理显著增加铁死亡标志物(脂质过氧化产物)和凋亡细胞比例(**P <0.01)，证明SCD1是RIFSP-2发挥保护作用的关键靶点。

1. RIFSP-2与STING信号通路的互作验证

A) 生物信息学分析显示RIFSP-2(绿色节点)与STING(红色节点)及其相关蛋白存在特异性互作网络。

B) 免疫沉淀实验表明，RIFSP-2显著抑制辐照后HaCaT细胞中STING的磷酸化(**P <0.01)。

C) Western blotting显示，RIFSP-2仅在STING野生型小鼠的原代皮肤细胞中抑制下游TBK1的磷酸化，而在STING敲除细胞中无此效应。

D) 生物素-亲和素系统验证RIFSP-2与STING在辐照细胞中的直接结合。

2. 脂质代谢物对STING激活的调控

E) 火山图分析表明，辐照显著上调中链脂肪酸(如LPC 18:1)，而RIFSP-2预处理逆转此趋势(** P <0.01)。

F) Western blotting显示，LPC(18:1)激活辐照细胞中STING下游信号(如p-TBK1、p-IRF3)，而RIFSP-2抑制该作用。

G) ELISA检测证实RIFSP-2减少辐照诱导的炎症因子(如IL-6、TNF-α)释放，且此效应在RAW 264.7巨噬细胞中同样显著(**P <0.01)。

3. RIFSP-2对自噬与焦亡的调控

H) 共聚焦显微镜和流式细胞术显示，RIFSP-2处理减少辐照细胞中自噬体(GFP+/RFP+)数量，但增加自噬溶酶体(GFP+/RFP-)形成，提示其缓解自噬流阻滞。

I-J) 联合使用STING抑制剂H151或SCD1抑制剂MF438时，RIFSP-2的抗焦亡效应(通过Gasdermin D裂解检测)被部分逆转(** P <0.01)，表明其作用依赖STING/SCD1通路。

4. 机制整合

结论：辐照诱导的中链脂肪酸(如LPC 18:1)通过激活STING-TBK1-IRF3轴驱动炎症反应和自噬失调，而RIFSP-2通过直接结合STING并抑制其磷酸化，阻断下游信号传导，减少炎症因子释放、自噬异常及细胞焦亡(N.S表示部分干预无显著差异)。

1. STING通路依赖性验证

A) CCK-8和LDH分析显示，RIFSP-2显著促进野生型小鼠原代皮肤细胞增殖并减少辐射诱导的细胞死亡(**P <0.01)，但在STING敲除(STING-KO)细胞中无此效应(N.S)。

B) 联合STING抑制剂H151时，RIFSP-2对辐照细胞中LDH释放(细胞毒性标志)的抑制作用被逆转(** P <0.01 vs. 未加H151组)。

C) AV/PI染色和JC-1染色表明，RIFSP-2减轻辐照导致的凋亡和线粒体膜电位崩溃，而H151处理阻断该保护作用(**P <0.01)。

2. 动物模型验证RIFSP-2疗效

D-E) 建立辐射诱导皮肤损伤模型和复合损伤(辐射+创伤)模型，实验组小鼠局部注射15 mg/kg RIFSP-2，对照组给予生理盐水。

F) 皮肤损伤评分显示，RIFSP-2显著缓解辐射导致的红斑、水肿和溃疡(** P <0.01 vs. 盐水组)。

G) 在复合损伤模型中，RIFSP-2治疗组小鼠伤口愈合速率加快(愈合曲线斜率更高，**P <0.01)，且炎症反应减轻。

3. 机制整合

结论：RIFSP-2通过靶向STING信号通路，抑制辐射诱导的细胞凋亡、线粒体功能障碍及炎症反应，且其体内外保护作用均依赖于STING功能完整性。动物实验进一步证实其显著缓解辐射皮肤损伤并促进创伤愈合。

1. RIFSP-2的来源与作用途径

来源于黑斑蛙的RIFSP-2通过巨胞饮作用(图2机制)进入皮肤细胞，靶向脂质代谢关键分子SCD1。

2. 分子机制：抑制MUFA生物合成

RIFSP-2直接结合SCD1(图3验证)，抑制其介导的单不饱和脂肪酸(MUFA，如油酸)生物合成。

MUFA减少可降低脂质过氧化产物(如LPC 18:1，图4结果)，阻断其对STING通路的激活。

3. STING信号通路调控

MUFA水平下降限制STING磷酸化(图4B-D)，抑制下游TBK1磷酸化及炎症因子(如IL-6、TNF-α)释放。

阻断STING-TBK1信号轴进一步减少细胞焦亡(Gasdermin D激活)和自噬异常(图4J)。

4. 细胞稳态保护效应

通过SCD1/STING双靶点作用，RIFSP-2维持线粒体功能(图2I-L)、肌动蛋白稳态(图2M-N)及脂质代谢平衡(图3I-K)，从而：

减轻辐射诱导的细胞周期阻滞(图2E)和衰老(图2F-G);

减少凋亡、铁死亡和坏死(图2N-P，图3M-P);

促进皮肤损伤修复(图5F-G)。

5. 机制整合示意图

核心通路：RIFSP-2 → SCD1抑制 → MUFA减少 → STING失活 → TBK1/焦亡/炎症下调 → 细胞稳态恢复。

研究结论

主要发现

肽类筛选与功能：

在电子束辐照的黑斑蛙(Pelophylax nigromaculatus)皮肤组织中鉴定出26种上调肽，其中4种(包括RIFSP-2)显著促进辐射损伤大鼠的伤口愈合。

RIFSP-2特性：

来源于组蛋白水解产物;

具有膜通透性，可维持细胞稳态;

通过抑制TBK1磷酸化，减少辐射诱导的细胞焦亡。

机制解析

靶点鉴定与作用途径：

直接靶点：利用链霉亲和素-生物素系统，确定SCD1(硬脂酰辅酶A去饱和酶1)为RIFSP-2的直接结合蛋白，SCD1是单不饱和脂肪酸(MUFA)生物合成的关键酶。

脂质代谢调控：脂质组学证实RIFSP-2抑制辐射后MUFAs(如油酸)的生物合成。

炎症与焦亡抑制：

MUFA减少限制辐射诱导的STING通路激活，降低TBK1磷酸化及下游炎症因子释放;

STING基因敲除或药物抑制(如H151)可逆转RIFSP-2对焦亡的抑制作用，延缓组织修复。

实验验证

动物模型验证：

RIFSP-2显著缓解辐射小鼠皮肤损伤(红斑、水肿、溃疡)并加速复合损伤(辐射+创伤)模型的伤口愈合。

核心通路：

RIFSP-2通过抑制“SCD1-MUFA-STING”轴，阻断辐射诱导的脂质代谢紊乱、炎症级联反应及细胞焦亡。

结论与意义

转化价值：应激诱导的两栖动物肽(如RIFSP-2)可作为新型辐射缓解剂的来源，其多靶点机制(SCD1-MUFA-STING)为辐射防护提供了创新策略。