体外高效，体内乏力？伏立诺他为何对mRNA疗法‘双标’？

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Effect of vorinostat on protein expression in vitro and in mRNA lipoplex administration

中文标题：伏立诺他对mRNA脂质复合物给药后体外和体内蛋白表达的影响

发表期刊：《Biomedical Reports》

影响因子：2.3

作者单位：

Department of Molecular Pharmaceutics, Hoshi University, Shinagawa, Tokyo 142-8501, Japan

作者信息：

MIN TANG, YOSHIYUKI HATTORI

研究背景

mRNA作为新型治疗工具，可通过快速表达功能蛋白在抗病毒疫苗和肿瘤治疗中展现潜力，但其易降解性和跨膜递送难题需依赖高效载体(如阳离子脂质体)。作者团队前期开发的DC-1-16/DOPE/PEG-Chol阳离子脂质体，可显著提升mRNA在肺和脾脏的体内外蛋白表达。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(如伏立诺他)通过染色质松弛增强DNA转染或基因组整合基因的表达，但其对mRNA转染后蛋白表达的影响尚未明确。本研究首次探讨伏立诺他是否通过调控mRNA翻译或稳定性增强蛋白表达，并评估其在体内外的作用差异，为mRNA药物与表观遗传疗法的联合应用提供依据。

研究方法

本研究通过体外和体内实验评估伏立诺他(vorinostat)对mRNA脂质复合物转染后蛋白表达的影响。体外实验：使用人宫颈癌HeLa细胞和肝癌HepG2细胞，通过CCK-8法测定伏立诺他的细胞毒性(IC50值)，并转染荧光素酶(FLuc)或EGFP mRNA脂质复合物(由DC-1-16/DOPE/PEG-Chol阳离子脂质体与mRNA按电荷比4:1制备)，检测伏立诺他(1或10 μM)对荧光素酶活性(化学发光法)和EGFP荧光表达的影响。体内实验：BALB/c小鼠静脉注射Cy5标记或FLuc mRNA脂质复合物，腹腔注射伏立诺他(5或25 mg/kg)，1小时后取器官观察mRNA分布(荧光成像)，4小时后检测组织荧光素酶活性(裂解液+化学发光法)。所有数据通过GraphPad Prism进行统计学分析(t检验或ANOVA)。

实验结果

图1：伏立诺他对HeLa和HepG2细胞的浓度与时间依赖性细胞毒性

通过测定伏立诺他对HeLa和HepG2细胞的毒性，发现其作用呈浓度和时间依赖性。HeLa细胞在24小时和48小时的IC50分别为7.8 μM和3.6 μM，而HepG2细胞因更高的敏感性，IC50分别为2.6 μM和1.0 μM。这一结果明确了后续实验选择1 μM(亚毒性浓度)和10 μM(接近IC50浓度)的合理性，为研究伏立诺他对mRNA转染的影响提供了毒性背景。

图2：伏立增强基因组稳定整合荧光素酶基因的表达

在稳定表达荧光素酶的HeLa-FLuc和HepG2-FLuc细胞中，伏立诺他显著增强基因组整合基因的表达。10 μM伏立诺他使HeLa和HepG2细胞的荧光素酶活性分别提高6.1倍和11倍，表明高浓度HDAC抑制剂通过染色质松弛机制促进基因转录。这与后续mRNA转染实验中低浓度增强、高浓度抑制的现象形成对比，提示伏立诺他对不同表达机制(DNA整合 vs. mRNA转染)的调控差异。

图3：低浓度伏立诺他提升mRNA转染的荧光素酶活性

低浓度伏立诺他(1 μM)显著提升mRNA转染的蛋白表达：HeLa和HepG2细胞的荧光素酶活性分别增加2.7倍和1.6倍，而10 μM浓度反而抑制活性至基础水平以下。这一结果表明，伏立诺他在低浓度下可能通过稳定mRNA或促进翻译效率增强表达，但高浓度因细胞毒性干扰了mRNA代谢或翻译过程，揭示了其作用的“双刃剑”特性。

图4：伏立诺他调控mRNA转染的EGFP荧光表达

通过EGFP荧光成像验证了伏立诺他对mRNA转染的调控作用。1 μM伏立诺他显著增强HeLa和HepG2细胞的EGFP荧光强度，而10 μM处理组荧光信号减弱，与荧光素酶实验结果一致。该结果进一步支持伏立诺他对不同报告基因(Luc/EGFP)的普适性调控，并排除了实验体系特异性的干扰。

图5：伏立诺他改变mRNA脂质复合物在小鼠体内的器官分布

小鼠体内实验显示，伏立诺他改变了mRNA脂质复合物的器官分布。未处理组中，Cy5标记的mRNA主要富集于肺部(因阳离子脂质体与红细胞相互作用形成肺部滞留)，而伏立诺他(5或25 mg/kg)共注射后，肝脏的mRNA信号显著增强。这表明伏立诺他可能通过调节脂质复合物与血液成分的相互作用，或影响肝脏摄取途径，从而重分布mRNA的体内靶向性。

图6：伏立诺他对小鼠体内荧光素酶表达的器官特异性影响

尽管伏立诺他改变了mRNA的器官分布，但对蛋白表达的影响有限。FLuc mRNA注射后，伏立诺他组肺部的荧光素酶活性较对照组下降约30%，而脾脏活性无显著变化。这种差异可能与肺部mRNA减少(分布至肝脏)及脾脏独立的递送机制有关，提示伏立诺他在体内对mRNA表达的调控受复杂器官微环境影响，而非直接增强翻译效率。

研究结论

体外：低浓度伏立诺他(1 μM，低于IC50)显著增强mRNA转染的蛋白表达(HeLa细胞荧光素酶活性提高2.7倍，HepG2提高1.6倍)，但高浓度(10 μM，接近IC50)抑制表达，表明伏立诺他通过稳定mRNA或促进翻译发挥作用，而非依赖染色质松弛。

体内：伏立诺他改变mRNA分布，使肺部积累减少、肝脏积累增加，但对蛋白表达影响有限(肺部荧光素酶活性轻微降低，脾脏无变化)，提示其体内效应可能与组织特异性代谢或mRNA递送路径改变有关。研究表明，伏立诺他可优化体外mRNA治疗，但对体内效果有限。