细胞裂解物中的mRNA展示技术用于鉴定靶向BRD3胞外末端结构域的环肽

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：mRNA Display in Cell Lysates Enables Identification of Cyclic Peptides Targeting the BRD3 Extraterminal Domain

中文标题：细胞裂解物中的mRNA展示技术用于鉴定靶向BRD3胞外末端结构域的环肽

发表期刊：《Angewandte Chemie International Edition》

影响因子：16.6

作者单位：Francis Crick Institute

作者信息：Catherine A. Hurd, Jacob T. Bush, Andrew J. Powell, and Louise 」. Walport*

研究背景

传统mRNA展示技术依赖纯化蛋白进行筛选，但难以应用于难以纯化的靶标(如易聚集蛋白、膜蛋白或需要翻译后修饰的蛋白)。本研究提出了一种直接在哺乳动物细胞裂解物中进行mRNA展示筛选的方法，无需靶标纯化，显著扩展了靶标范围。以NanoLuc亚基(LgBiT)和全长溴结构域蛋白BRD3为模型，成功筛选出低至亚纳摩尔级亲和力的环肽配体，特别是首次靶向BRD3的胞外末端(ET)结构域，填补了该领域的工具空白。

研究方法

1. 靶标表达与捕获：

在HEK293T细胞中过表达3xFlag或HiBiT/V5标签的靶蛋白(如LgBiT、BRD3)。

通过抗体包被磁珠(如抗Flag、抗HiBiT)从裂解物中免疫沉淀靶蛋白。

2. mRNA展示筛选：

使用RaPID系统(结合非标准氨基酸翻译和mRNA展示)构建环肽库(>10^12多样性)。

通过多轮正负筛选(去除非特异性结合)富集靶标结合肽。

3. 结合验证：

利用NanoBRET竞争实验、表面等离子共振(SPR)和Westernblot验证肽与靶标的结合及亲和力。

实验结果

图1：细胞裂解物中mRNA展示筛选流程

展示RaPID筛选的关键步骤，包括翻译、反转录、正负筛选(通过抗体磁珠捕获靶蛋白-肽复合物)，以及PCR扩增富集序列。

图2：LgBiT靶标筛选与验证

A部分：NanoBiT系统原理(LgBiT与HiBiT互补形成活性荧光素酶)。

B-D部分：筛选结果(DNA回收率、序列富集分析)，显示从裂解物和纯化蛋白中均筛选出高亲和力肽(K_i=0.5–0.9nM)。

E部分：竞争实验验证肽与HiBiT共享LgBiT结合位点。

图3：全长BRD3的筛选与肽配体表征

A部分：BRD3结构预测(含溴结构域和ET结构域)。

B-D部分：环肽库设计、筛选结果及NGS分析，发现ET结构域特异性结合肽(如BRD3_p6，K_i=4.8nM)。

E部分：NanoBRET竞争实验验证肽结合一致性。

图4：BRD3ET结构域结合与家族交叉反应

A部分：截短实验证实肽结合依赖ET结构域。

B部分：肽对BRD家族(BRD2/3/4)的亲和力差异(BRD4亲和力接近BRD3，BRD2弱3–50倍)。

C部分：生物素化肽下拉内源性BRD蛋白，验证功能性结合。

研究结论

1. 方法创新性：首次实现细胞裂解物中mRNA展示筛选，避免靶蛋白纯化，适用于复杂或难表达蛋白。

2. 靶标突破：筛选出针对BRD3ET结构域的环肽(K_D低至4.7nM)，填补了该结构域化学探针的空白。

3. 广谱性：肽配体对BRD家族成员(BRD2/3/4)具有交叉结合能力，但亲和力差异显著(BRD4亲和力接近BRD3，BRD2较弱)。

4. 应用潜力：通过生物素化肽成功下拉内源性BRD蛋白，验证了其作为工具探针的实用性。