双剑合璧！中国团队突破性癌症疗法：DNA疫苗+基因PD-1抗体，小鼠生存率超60%！

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：Enhanced Anti-Tumor Efficacy Through a Combination of Intramuscularly Expressed DNA Vaccine and Plasmid-Encoded PD-1 Antibody

中文标题：通过肌肉内表达的DNA疫苗与质粒编码的PD-1抗体联合增强抗肿瘤效果

发表期刊：《Frontiers in Immunology》

影响因子：5.7

作者单位：

1.National Engineering Research Center for Biomaterials, College of Biomedical Engineering, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China

2.Department of Medical Oncology/Gastric Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China

作者信息：

Xun Liu, Yueyao Yang, Xiufeng Zheng, Ming Liu, Gang Wang

研究背景

免疫检查点抑制剂(ICIs)在部分恶性肿瘤中仅表现出中等的临床响应率(约20%-30%)，而联合治疗(如DNA肿瘤疫苗)可能优化疗效。本研究开发了一种基于肌肉特异性高效启动子(EMS)的DNA疫苗(编码抗原OVA)，结合质粒编码的PD-1抗体(pVAX-α-PD-1)，通过L/E/G(Pluronic L64/电穿孔/表没食子儿茶素没食子酸酯)系统进行体内基因递送。在MC38-OVA和B16-F10-OVA肿瘤模型中，验证了该联合方案的抗肿瘤效果及免疫激活机制。

研究方法

本研究通过构建编码小鼠PD-1抗体(α-PD-1-Fc)的pVAX质粒和基于肌肉特异性高效启动子(EMS)的OVA DNA疫苗(pEMS-OVA)，采用L/E/G(Pluronic L64/电穿孔/表没食子儿茶素没食子酸酯)系统进行肌肉内基因递送。实验使用HEK293T细胞验证抗体表达(Western blot和ELISA)，并建立MC38-OVA(结肠癌)和B16F10-OVA(黑色素瘤肺转移)小鼠模型。在MC38-OVA模型中，小鼠分别接受pEMS-OVA疫苗(三次免疫)和pVAX-α-PD-1单次注射;B16F10-OVA模型通过尾静脉注射肿瘤细胞模拟转移。通过ELISpot检测脾细胞IFN-γ分泌，流式细胞术分析外周血和脾脏CD8+ T细胞比例，免疫组化评估肿瘤浸润淋巴细胞，并监测血清细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10)及肝功能指标(ALT/AST)以评估安全性和免疫激活效应。

实验结果

图1：PD-1抗体的基因构建与功能验证

通过基因工程将小鼠PD-1抗体的单链可变区(scFv)与IgG1 Fc区(D265A突变)融合，构建pVAX-α-PD-1-Fc质粒。Western blot显示转染HEK293T细胞后上清液中存在约120 kDa的抗体蛋白(非还原条件)，ELISA进一步证实其能剂量依赖性结合小鼠PD-1抗原，验证了质粒编码抗体的功能完整性，为后续体内表达奠定基础。

图2：MC38-OVA模型中联合治疗的抗肿瘤效果

单用pEMS-OVA疫苗或pVAX-α-PD-1仅微弱抑制肿瘤，而联合治疗显著延缓肿瘤生长(第15天肿瘤体积较对照组减少70%)，且60%小鼠长期存活(45天)。生存曲线显示，单独α-PD-1治疗组仅20%存活，凸显联合疗法的协同效应。体重监测表明治疗无系统性毒性，支持其安全性。

图3：免疫激活与肿瘤微环境调控

ELISA显示联合组血清IL-2(Th1相关)、IL-4(Th2相关)和IL-10(抗炎/免疫调节)水平均显著升高，提示多通路免疫激活。ELISpot证实联合治疗诱导更高频率的OVA特异性IFN-γ分泌细胞(较单药组增加3倍)。免疫组化显示肿瘤内CD8+ T细胞密度显著增加(联合组较对照组高2.5倍)，表明PD-1阻断解除T细胞耗竭，增强杀伤功能。

图4：B16F10-OVA肺转移模型的疗效评估

联合治疗组肺表面转移结节数较对照组减少80%，肺湿重接近正常水平，而缺乏L/E/G系统的疫苗组(pCMV-OVA-none)疗效显著下降，证明L/E/G对基因递送效率的关键作用。此外，联合治疗组小鼠体重稳定，无恶病质表现，进一步支持治疗耐受性。

图5：肺组织病理学分析

H&E染色显示对照组肺组织充满黑色素瘤转移灶，联合治疗组仅见零星微小病灶，接近正常肺结构。病理结果直观印证联合治疗对转移的强效抑制，且无治疗相关肺部炎症或纤维化等副作用。

图6：T细胞亚群与安全性分析

流式显示联合组外周血CD8+ T细胞比例达45%(对照组25%)，脾脏CD8+ T细胞比例提升至27%，表明系统性免疫激活。肝功能指标(ALT/AST)无组间差异，脾脏重量正常，排除免疫过度激活风险，证实治疗安全性。

研究结论

联合治疗(pEMS-OVA疫苗 + pVAX-α-PD-1)在MC38-OVA模型中显著抑制肿瘤生长，使60%小鼠生存期延长至45天(对照组全部死亡)，并减少B16F10-OVA肺转移结节数量(联合组肺重接近正常)。机制上，联合治疗通过以下途径增强抗肿瘤免疫：1)激活抗原特异性T细胞，脾细胞IFN-γ分泌增加;2)促进CD8+ T细胞浸润肿瘤(免疫组化显示肿瘤内CD8+ T细胞密度升高);3)上调血清IL-2、IL-4、IL-10水平，协同调节免疫应答。安全性方面，未观察到显著肝毒性(ALT/AST正常)或体重异常变化。该研究证实，基于肌肉基因递送的DNA疫苗与PD-1抗体联合策略兼具高效性与安全性，为肿瘤免疫治疗提供了经济的新方案。