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ATCC细胞培养
产品规格：100mL
¥500
产品规格：100mL
¥98
产品规格：100mL
¥68
外泌体是细胞分泌的含有 RNA 和蛋白质的囊泡 (30-200 nm)，在体液中大量存在，包括血液、唾液、尿液和母乳等。外泌体在细胞间充当信使，运送货物特异性使其具有不同的功能。然而，外泌体的形成、货物的分选方式以及它们参与的生物途径仍未完全研究清楚。外泌体研究需要分离得到完整的外泌体，当前超速离心是分离的金标准，但这需要昂贵的设备。
本试剂盒提供了一种分离纯化人和小鼠血清或血浆中的外泌体的简单可靠的方法。通过促进不易溶解的组分(即外泌体)从溶液中沉淀，操作简单，结果重复性好，杂蛋白含量少，只需普通离心机就可以分离得到较纯的完整外泌体，可用于电镜粒径分析，RNA和蛋白分析，以及细胞和动物实验等。
本说明书适用于从人和小鼠血清或血浆中纯化外泌体，请严格参照说明书操作。本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途!
(1)运输条件：冰袋运输，国内现货 2~3 天即可送达。
(2)储存条件：Proteinase K -20℃储存，其他组分常温储存。
表1. 试剂盒组成信息
| 产品货号 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
| IME-I002S | Proteinase K (20mg/mL) | 0.1 mL | -20℃，2年 |
| Exosome Concentration Solution | 1 mL | 常温，2年 | |
| Exosome Purification Filter | 2 Tubes | ||
| IME-I002 | MProteinase K (20mg/mL) | 1 mL | -20℃，2年 |
| Exosome Concentration Solution | 6 mL | 常温，2年 | |
| Exosome Purification Filter | 20 Tubes |
冷冻高速离心机，2 mL 离心管，1×PBS 缓冲液(无菌)。
全血预处理：
1、收集血液样本在有抗凝剂的收集管中，在4℃ 2000g离心10min，收集上层液体，即血浆;或室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，在4℃ 2000g离心10min，上清液即为血清。如果是冻存样本，在室温或25℃水浴直至完全溶解。
2、将所需体积的澄清血浆(这里以500 µL为例，不满500 µL用PBS补足)转移到新的2mL EP管并加入等体积的 1× PBS，混合样品，在4℃ 3000g离心30min去除细胞碎片或死细胞，若沉淀较多，重复该步骤一次。
3、将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃以 10000g离心 30 min，去除样品中的大囊泡，处理后的上清液转移到新离心管中。
去除杂蛋白：
注：通过蛋白酶 K 处理从血浆中去除大部分蛋白质，但这可能会导致外泌体表面的蛋白质部分降解。如果这对您的研究有影响，请跳过此步骤，直接进行外泌体提取。
向样品中加入 0.05 倍体积的蛋白酶 K，例如，对于 500 μL 起始体积的血浆，添加 25 μL Proteinase K。混匀样品，然后在37°C下孵育10 min。
外泌体提取：
1、在处理后的离心上清液中按4：1加入 ECS，如1 mL上清液加入0.25 mL的Exosome Concentration Solution(ECS)(注：使用前上下颠倒5-6次混匀)。
2、通过涡旋震荡器混匀1min或上下倒置10-12次，直到溶液均匀。
3、将样品在4℃孵育1h以上(增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h)。
4、孵育后，将样品在4℃以 10000g 离心 60min，移液吸出上清液并丢弃，尽量吸干液体。(注：如果使用的是定角转子，沉淀分布在离心管外侧整个侧面)。
5、将试管以 10000g 离心2min，弃去上清，至无任何残留液体。
6、取适量1×PBS 重悬外泌体(建议每 500 μL血浆用 50~100 μL 左右 1×PBS 重悬)。
7、将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中，于 4℃以 3000 g离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒(注：EPF柱不可重复使用)。
8、纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。
(1)使用前请仔细阅读说明书，建议严格参照本说明书进行纯化外泌体操作。若需技术支持，欢迎随时致电。
(2)操作过程中需使用无菌器材和试剂，避免外泌体样本被污染。
(3)抗凝剂避免肝素(可能干扰下游PCR分析)，推荐EDTA或柠檬酸钠。
(4)孵育和离心步骤需在4℃下进行，以保持外泌体的稳定性。
(5)提取的外泌体可重悬于PBS中，分装后于-80℃保存，避免反复冻融。
(1)提取的外泌体如何保存?
短时间内使用，可在 2~8℃短暂保存1~2天，若长时间保存，建议放在-80℃冰箱中，避免反复冻融。此外，可使用商业化的外泌体储存试剂，进一步保护外泌体。
(2)重悬的外泌体颗粒不能通过或部分通过纯化柱，如何处理?
当提取的外泌体含有较多的污染蛋白质，离心经过纯化柱时可能会堵塞滤膜，因此，重悬时需要多次吹打，彻底溶解沉淀，然后在经过纯化柱纯化。
(3)如何鉴定提取的外泌体?
一般确定外泌体一般需要三个条件：电镜形态观察，颗粒粒径测定和蛋白标志物检测(Western Blot 检测CD9、CD63以及CD81任意两个表达阳性;Alix、Tsg101任意一个表达阳性;Calnexin、histone 3以及GM130任意一个表达阴性)。
细胞培养时培养基是否需要预热
细胞培养时培养基需要预热。预热培养基可以减少环境的改变对细胞状态的影响，避免细胞因温度变化而产生应激反应，从而保持细胞的健康状态和生长环境的一致性。可以提前半小时左右，将培养基、PBS和胰酶在37°C下预热，把所需耗材和其他物品放置于超净工作台中紫外照射灭菌。
血清使用前需不需要灭活
一般培养细胞所使用的血清不需要灭活，灭活会导致血清部分营养损失、沉淀增多，灭活的优势(主要是灭活补体以免影响细胞生长)在实际培养过程中对于促进细胞生长并没有太大意义。部分细胞对于生长条件敏感，可以尝试灭活血清培养，但大部分细胞并不需要。
血清融化后有沉淀会影响细胞培养吗
血清沉淀主要是纤维蛋白等蛋白、磷酸盐、脂类等经冻融后析出，导致血清内出现沉淀现象，该现象与血清品质无关，大部分品牌的血清都会有这种情况，不会影响细胞培养，只是培养时可能偶尔观察到血清沉淀，注意区分血清沉淀和细胞污染即可。
细胞为何生长不均匀
细胞传代后放入培养箱没有摇匀，或者放入时摇匀，但在细胞贴壁前，又移动了培养瓶，频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少，培养箱搁板表面不平整，这些因素会导致细胞生长不均匀。
细胞抱团怎么处理
一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试一下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。
细胞内有空泡，是否是正常现象
部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等)，这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。
细胞传两代后开始逐渐死亡的原因
很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系)；或者消化过度，对细胞有严重影响；或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞，传代太稀；或者生长较快的细胞，传代较密，细胞严重堆叠生长)。
如何区分活细胞和死细胞
显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。
何用台盼兰计数活细胞
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行
何时须更换培养基
视细胞生长密度而定，常规细胞2天更换培养基。
细胞何时进行传代较好
一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。
贴壁细胞总有部分圆形还会有一些漂浮的是正常吗
大部分贴壁细胞培养时都会有一些圆形透亮的细胞存在，也会有一些圆形细胞脱落悬浮的情况存在，这种主要是一些新增殖的细胞或由于局部空间不足被挤出的细胞，只要细胞持续增殖，都会有一些圆形细胞或脱落漂浮细胞，不影响细胞整体增殖和实验，保持正常换液、传代周期即可。细胞具体情况也可以参考细胞库不同细胞照片比对，大部分贴壁细胞都会有圆形细胞、脱落细胞、细胞内颗粒等情况。
细胞内很亮小泡泡是什么东西
一部分情况下细胞内小亮点是细胞内黑色颗粒或者一些粘附在细胞表面的碎片，这种黑点会在调整显微镜焦距时呈小黑点或者小亮点，容易被误认为细胞内小泡，其实只是细胞内部或表面一些物质折光形成的光学现象。也有些是细胞内部脂滴，例如3T3-L1细胞在部分培养条件下可以明显看到内部脂滴，染色后更加清晰。
部分细胞在培养时确实可能会有空泡，可以参考细胞库照片比对。若细胞突然出现细胞内空泡增多现象，通常是细胞受到压力的表现，原因可能是培养基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌剂、不适当的CO2环境对培养基中碳酸氢钠浓度影响或培养基的营养消耗殆尽。
细胞培养出现小黑点、污染如何防范
可从以下几个方面进行判断： 细胞小黑点如何判断 1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。 2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。 3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。碎片?细菌?一目了然。
细胞培养形态与ATCC等官网照片有点区别正常吗?
由于每个实验室培养环境、操作方法、培养基及血清品牌批次不同，细胞实际培养形态、状态、生长速度等培养特性均有可能发生改变，甚至显微镜拍摄效果对细胞形态判断都会有有一定影响。因此细胞形态只能作为实验过程中的参考项目，无法作为细胞状态或者类型的判断依据。实际上，细胞在不同细胞库培养的细胞形态都可能存在一定差异。
问：为什么官网的培养条件和我看的文献里细胞培养条件不一样呢？
答：部分细胞是会出现多种培养条件，我们公司优先选择引种来源的培养条件以及建系者所用培养条件，出现差异的原因是不同实验室在保藏过程中更改了细胞的培养条件，为了避免细胞突然更换培养条件后不适应，建议老师使用厂家推荐的培养条件培养。
问：冻存细胞运输与常温细胞运输相比有什么区别？
答：细胞株发货有常温或者冻存两种形式，常温细胞货期一般一周左右，复苏活细胞一个T25瓶发货；冻存细胞有库存的话，一般当天或者隔天可以发货，细胞系冻存细胞担心客户复苏不成功所以赠送了一管，实际发货2管；原代冻存细胞发货1管，冻存细胞发货是10公斤干冰及顺丰运输，所以冻存细胞需额外支付干冰及运输费200元。
问：培养细胞的培养瓶可以重复利用吗？
答：一般不建议重复利用，特别是贴壁不牢固细胞，重复利用会导致吸附性变差，漂浮增多;一个T25瓶建议使用最多不超过3次，其次需要注意无菌操作，避免污染。
问：运输细胞用的培养基可以回收使用吗?
答：不能回收使用的，运输用的培养基(灌液培养基)营养在路上已经消耗得差不多，所以收到细胞之后，培养箱静置4-6h之后，请及时按照说明书细胞培养条件更换新鲜培养液培养。
问：冻存的细胞出现颜色不一致，有的红有的粉，对复苏会有影响吗？
答：这种情况容易在不同冻存批次间出现，与冻存细胞的密度、冻存液配方、温度导致pH变化等有关，偶尔有遇到这种情况，不是绝对性对细胞状态有影响，可以复苏看下。
问：不同引种单位的同一株细胞，RRID都是一样的吗？
答：是的，同一个细胞系只有一个RRID。
1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液，细胞未开封，如出现污染状况等，重发
2.细胞免费售后期为一周，一周内细胞培养出现异常及时拍照反馈。超出一周没有任何反馈视为细胞培养正常，后期若出现培养问题不再免费重发
3.申请售后时请提供细胞收货时及反馈售后当天细胞清晰照片及培养信息，若无清晰照片及相应信息，不予免费售后
4.售后仅针对由于细胞自身状态问题导致不可传代的情况，若客户收货一周内已经传代或转移细胞多次，出现死亡或者污染时不予免费售后
5.冻存细胞发货2管，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复苏第二支。若客户未反馈并复苏2管失败，我方将不提供免费售后服务。冻存细胞售后均发复苏培养，若要重发冻存细胞，需补加200元干冰运输费用
6.客户自行冻存细胞一定要注意冻存后复苏一管检查冻存活性，避免冻存死亡导致绝种。我方不对客户冻存细胞死亡负责，客户冻存细胞死亡时不予免费售后
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