C6-NLUC-puro大鼠脑胶质瘤细胞尾静脉成瘤验证

肺转移：21-28天

脑转移：28-35天

21-35天(肺/脑转移灶延迟出现）

1.颅骨衰减(原位模型)

2.细胞活性低(传代过度/冻存损伤)

3.底物furimazine失效

1.信号补偿：

预实验测算衰减系数(通常×1.5-2.0)

2.细胞活性控制：

-使用≤P15代细胞

-复苏后培养≥48h再接种

3底物管理：

--80℃分装避光保存

-注射前37℃复温

体外NLuc活性检测(≥5×108RLU/mg)

添加阳性对照细胞(如HEK293-NLuc)

成瘤率低

(原位<80%,皮下<90%)

1.接种细胞密度不足

2.注射技术失误(原位返流/皮下渗漏)

3.免疫排斥(免疫健全动物 )

1.密度优化：

-原位：5×10⁴/μL+10%Matrigel

-皮下：1×107/0.1mL

2.技术规范：

-原位：留针2min,退针1μm/min

-皮下：针头预涂PBS防粘附

3.免疫管理：

-免疫健全鼠用环磷酰胺预处理 (50mg/kg,接种前3天)

接种后即刻活体成像确认细胞滞留

组织切片验证接种位点肿瘤细胞

1.颅内压骤升(原位注射过快/体积过大)

2.肺栓塞(尾静脉注射气泡或细胞团块)

3.感染(手术器械污染)

1.注射参数：

-原位：≤1μL/min,总量≤10μL

-尾静脉：0.2mL注射器+细胞滤网(40μm)

2.无菌操作：

-高温灭菌立体定位仪配件

-术后腹腔注射恩诺沙星(5mg/kg)

尸检确认死因(脑出血/肺栓塞)

细菌培养检测感染源

1.免疫清除(未用免疫缺陷鼠 )

2.转移灶休眠(细胞侵袭力不足)

3.成像灵敏度不足

1.动物模型：改用NSG小鼠(T/B/NK三缺陷 )

2.细胞强化：

-体内传代筛选高转移亚株

-过表达MMP9/CD44

3.成像优化：

-曝光时间延长至300s

-腹腔注射底物增至150μL

肺组织HE染色检测微转移灶

体外Transwell验证侵袭力提升

1.底物非特异性结合

2.动物毛发/粪便残留荧光

3.仪器校准偏移

1.底物净化：离心后取上清(16,000g,5min)

2.样本准备：

-剃毛+酒精清洁皮肤

-成像前禁食4h

3.设备维护：

-每月黑场校准

-使用标准光源校验"

1.阴性对照(PBS接种)

2.C6-NLUC-Puro组(3个密度梯度)

3.母本C6细胞对照

原位接种：

·密度：5×10⁴/μL,1×105/μL,2×105/μL

· 体积：5μL/只

·坐标：前囟后1.0mm,右偏2.5mm,深3.0mm

·活体成像：D3/7/10/14(底物150μL,注射后10min成像)

· 组织学：D14取脑(H&E,GFAP/IHC)

· 生存分析：≥D30

· 信号强度-时间曲线

· 侵袭距离(距接种点mm)

· 中位生存期

1.对照组

2.放疗单药(6Gy×3)

3.替莫唑胺单药(50mg/kg)

4.联合组

原位接种：

· 密度：1×10⁵/μL

· 体积：5μL/只(SD大鼠)

·成像监测：治疗前+治疗后D3/7/14

·MRI:D14(T2加权测瘤体积)

·流式细胞术：D7瘤组织(凋亡/细胞周期)

· 相对信号衰减率(vs基线)

· 肿瘤控制率(TCDso)

·Caspase-3阳性率

1.1gG对照组

2.抗PD-1单药(10mg/kg,Q3D×4)

3.C6-NLUC-Puro+免疫健全C57BL/6鼠

原位接种：

· 密度：8×10⁴/μL

· 体积：3μL/只(小鼠)

· 成像：D7/14/21

·流式：D14脑组织(CD8+T细胞， Treg,MDSC)

·ELISA:血清IFN-Y

·肿瘤浸润CD8+T细胞占比

· 信号增长延迟时间

· 长期生存率(≥D60)

1.NSG对照组

2.C6-NLUC-Puro组

3.高转移亚株(C6-LM)

尾静脉注射：

·密度：1×106/0.1 mL

·注射器：29G胰岛素针+40μm滤网

·全身成像：W2/3/4

· 离体器官成像： W4(肺/脑/肝)

· 组织学：肺切片(H&E计数转移灶)

· 转移器官分布率

· 荧光强度-转移灶数量相关性

· 微灶大小(μm)

>1.游离药物组

2.纳米载体组

3.靶向肽修饰载体组

原位接种：

· 密度：1×10⁵/μL(BALB/c裸鼠)

·成像：给药前+给药后2h/24h

·LC-MS/MS:D24脑组织药物浓度

· 电镜：瘤周血脑屏障紧密连接

· 脑/血浆药物浓度比

·瘤内NLuc信号抑制率

· 载体蓄积效率