PBMC细胞分离步骤,培养方法和分离原理

外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)是外周血(即除骨髓以外的血液)中具有单个核的细胞的混合细胞群体，包括自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、T淋巴细胞(70%-90%)、B淋巴细胞。能够进一步分离纯化，是免疫细胞的主要来源。

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells ，PBMC)是免疫系统的关键组成部分，因此在免疫学、传染病、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗、个性化医学和毒理学等领域作为最基础的实验原料被广泛使用。

PBMC细胞原理

单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其它细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重超过1.080，单个核细胞的比重为1.070左右，血小板为1.030左右。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。

从血液制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群之前常见的一个步骤。最常用的PBMC分选方法是使用密度梯度离心液进行离心。

Ficoll密度梯度离心法是分离、纯化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，故常用作PBMC分离的分离液。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重，离心后漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分层液液面上的白膜层细胞，并进行适当的清洗，就可从外周血中分离到较高纯度的单个核细胞，即PBMC。

PBMC细胞分离实验准备注意事项

在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。以下是一些需要注意的事项

1.血液样本的采集和处理

在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。采血时应注意以下几点:首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性;其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血;最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。

2.实验器材和试剂的准备

在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。

将分离液的温度平衡至室温(RT)，避光。

样品准备：抗凝全血或骨髓。根据样本浓度状态，可适当用生理盐水稀释，提高分离效果。

3.操作过程注意事项

在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项

1.离心速度和时间的选择

离心是PBMC分离的重要步骤之一。在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。

2.操作过程的无菌化处理

在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

3.细胞的洗涤和处理

在离心后，需要对细胞进行洗涤和处理。应使用适当的洗涤液去除杂质和死细胞，并轻轻拍打离心管底部以帮助细胞悬浮和去除杂质。在洗涤过程中应避免使用太大的力气或过多的液体，以免影响细胞的活性或数量。处理后的细胞应尽快进行后续实验或存储。

PBMC细胞分离方法

1.取新鲜抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀释洗涤液，将血液进行稀释(以降低血液粘稠度)，轻柔混匀，备用。

2. 向无菌离心管内加入适量的单个核细胞分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方(分离液：稀释全血=1：2)，保持两液面界面清晰。

3. 800g，室温，离心 20min-30min(注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档)。

4. 离心结束后，吸弃血浆层，小心吸取PBMC层(即白膜层)并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为稀释血浆层、PBMC层、分离液层和红细胞层(见图1)。

图稀释外周血离心前后的分层状态图

5.向离心管中加入10mL 的1×稀释洗涤液重悬细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。

6.细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率(%)=活细胞数/总细胞数(%)。

7.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于六孔板或24孔板中进行培养。

8.细胞收集：将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200µL Trizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。

9.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。

PBMC细胞分离注意事项

1.不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异，请选择合适的分离液进行PBMC的分离。

2.血液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24h内的血液进行PBMC分离。

3.为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。

4.为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。

5.离心后收获细胞前，也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层，有助于防止被血小板污染。

6. 离心后倾倒上清时不要将分离管倒置2s以上。

7.分离管请勿重复使用。