MIAPACA2细胞培养基,会结团吗,复苏要多久介绍

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞简介

MiaPaCa-2细胞由A.Yunis等人于1975年从65岁白人男性胰腺肿瘤组织建系的。MiaPaCa-2细胞是一个亚二倍体人类细胞系，模式染色体数为61。一个细胞中通常有16至20条标记染色体，少数正常染色体缺失。MiaPaCa-2细胞表达人集落刺激因子I亚类(CSF-I)，纤溶酶原激活剂基因。据报道，MiaPaCa-2细胞具有约40小时的倍增时间和约19%的软琼脂集落形成效率，细胞对天冬酰胺酶敏感。MiaPaCa-2细胞可用于3D细胞培养和癌症研究。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞产品信息

细胞名称：MIA-PACA-2人胰腺癌细胞

细胞别称：MIA-PaCa-2; MIA-PACA-2; MIA-Pa-Ca-2; MIA Paca2; MIA PaCa2; MiaPaCa-2; MIAPACA-2; MiaPaca.2; MiaPaCa2; Miapaca2; MIAPaCa2; MIAPACA2; Mia PACA 2; MIAPaCa-2; PaCa2;人胰腺癌细胞

种属来源：人

年龄性别：男;65岁

组织来源：胰腺

生长特性：半贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：AMEL：X，X;CSF1PO：10，10;D12S391：19，19;D13S317：12，13;D16S539：10，13;D18S51：12，12;D19S433：15，15;D21S11：29，31.2;D2S1338：25,25;D2S441：14，14;D3S1358：16，16;D5S818：12，13;D6S1043：12，12;D7S820：12，13;D8S1179：16，16;FGA：22，22;Penta D：12，16;Penta E：13，18;TH01：9，10;TPOX：9

保藏机构：ATCC; CRL-1420 DSMZ; ACC-733 ECACC; 85062806 JCRB; JCRB00

培养基：90%DMEM+10%FBS+2.5%马血清+双抗

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

倍增时间：26 hours (PubMed=25984343); 25.7 +- 4.3 hours (PubMed=27067801); 40 hours, 18 hours, in serum-free medium (PubMed=23386380); ~40 hours (ATCC); ~30-40 hours (DSMZ)

基因表达情况：human colony stimulating factor, subclass I (CSF-I); plasminogen activator

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞形态特征

MIA-PACA-2细胞形态特征半贴壁生长，上皮细胞样，可用于3D细胞培养和癌症研究。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、马血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞复苏步骤

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLMIA-PACA-2细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将MIA-PACA-2细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定MIA-PACA-2细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞传代操作

从培养箱拿出MIA-PACA-2细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当MIA-PACA-2细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有MIA-PACA-2细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定MIA-PACA-2细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞冻存准备

从培养箱拿出MIA-PACA-2细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

MIA-PACA-2细胞冻存步骤

a.收集mia paca-2细胞系及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在MIA-PACA-2细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞培养常见问题

1.MIA-PACA-2人胰腺癌细胞收到货细胞缩回圆形?

Mia-paca-2细胞对培养条件极为敏感，不可脱离培养箱太久，否则细胞形态会由梭形形态缩回圆形，运输过程中容易掉落，故在查看状态时，建议及时尽快放回培养箱。

2.MIA-PACA-2人胰腺癌细胞换液注意事项?

MIA-PACA-2细胞在换液时，培养液需要恢复至常温后换液，但是也容易回缩，重新恢复状态至少需要24小时。

3.MIA-PACA-2细胞消化之后成团?

MIA-PACA-2细胞容易堆叠生长，消化时尽量消化为单颗，该细胞形态偏梭形，汇合度在90%即可传代。

4.MIA-PACA-2细胞有许多漂浮的细胞，需要收集起来吗?

MIA-PACA-2细胞为半贴壁细胞，若细胞漂浮太多，需收集上清重新铺回皿中。

MIA-PACA-2人胰腺癌细胞应用

探讨长链非编码RNA Linc00152对人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2增殖、侵袭和迁移能力的影响。

方法：于医院胆胰科采集到20对胰腺癌组织和其对应的癌旁正常的胰腺组织;人正常胰腺细胞HPDE及各组胰腺癌细胞系MIA PaCa-2细胞、BxPC-3细胞、Capan2细胞购于美国ATCC细胞库。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证组织及各组细胞中Linc00152的表达水平。

人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2细胞随机分为阴性对照组(si-NC组)和Linc00152下调组(si-Linc00152组)。设计Linc00152的siRNA(small interfering RNA)干扰模型,si-NC组和si-Linc00152组分别转染阴性对照序列(Negative control)、siRNA抑制序列,采用RT-qPCR验证两组MIA PaCa-2细胞中Linc00152的转染效率并进行后续实验。

采用CCK-8法和集落形成实验检测两组MIA PaCa-2细胞的增殖能力;流式细胞术检测两组MIA PaCa-2细胞的细胞周期;Western-blot检测两组胰腺癌细胞MIA PaCa-2的细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4的表达:

采用Transwell实验和细胞划痕实验测两组MIA PaCa-2细胞的侵袭、迁移能力;Western-blot检测两组MIA PaCa-2的细胞相关蛋白vimentin及N-cadherin的表达水平。结果:与癌旁正常的胰腺组织相比,Linc00152在胰腺癌组织中表达明显增加(P<0.001),Linc00152在胰腺癌细胞系中的表达均高于人正常胰腺细胞HPDE,且在MIA PaCa-2中表达最高(P<0.01)。

成功设计siRNA干扰模型,将阴性对照序列、siRNA抑制序列转染48 h后,RT-qPCR结果显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中的Linc00152表达明显降低(P<0.01)。分别于6 h、24 h、48 h、72 h、96 h加CCK-8溶液测两组MIA PaCa-2的细胞活力,结果与si-NC组相比,si-Linc00152组中的细胞在48 h、72 h、96 h增殖显著下降(P<0.01)。

集落形成实验8天后,si-NC组的集落形成数目是(412±12),而si-Linc00152组的集落形成是(226±8),结果显示沉默Linc00152后细胞克隆数目明显减少(P<0.01)。流式细胞术结果显示沉默Linc00152后,与si-NC组相比,si-Linc00152组MIA PaCa-2在细胞周期中的G0/G1期百分比上升,提示发生了细胞周期阻滞(P<0.01)。

Transwell侵袭实验显示,沉默Linc00152后细胞侵袭的数目明显减少(P<0.01)。Transwell迁移实验中显示,沉默Linc00152后细胞迁移的数目明显减少(P<0.01)。细胞划痕实验结果均显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中细胞迁移,侵袭能力也显著降低(P<0.01)。

MIA-PACA-2细胞参考文献

PubMed=1764370; DOI=10.1038/bjc.1991.467

Barton C.M., Staddon S.L., Hughes C.M., Hall P.A., O'Sullivan C., Kloppel G., Theis B., Russell R.C.G., Neoptolemos J., Williamson R.C.N., Lane D.P., Lemoine N.R.

Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer.

Br. J. Cancer 64:1076-1082(1991)

PubMed=1630814

Ruggeri B., Zhang S.-Y., Caamano J., DiRado M., Flynn S.D., Klein-Szanto A.J.P.

Human pancreatic carcinomas and cell lines reveal frequent and multiple alterations in the p53 and Rb-1 tumor-suppressor genes.

Oncogene 7:1503-1511(1992)

PubMed=7809022; DOI=10.1097/00006676-199409000-00018

Sumi S., Beauchamp R.D., Townsend C.M. Jr., Pour P.M., Ishizuka J., Thompson J.C.

Lovastatin inhibits pancreatic cancer growth regardless of RAS mutation.

Pancreas 9:657-661(1994)

PubMed=7961102; DOI=10.1111/j.1349-7006.1994.tb02898.x

Suwa H., Yoshimura T., Yamaguchi N., Kanehira K., Manabe T., Imamura M., Hiai H., Fukumoto M.

K-ras and p53 alterations in genomic DNA and transcripts of human pancreatic adenocarcinoma cell lines.

Jpn. J. Cancer Res. 85:1005-1014(1994)

PubMed=8026879; DOI=10.1002/ijc.2910580207

Berrozpe G., Schaeffer J., Peinado M.A., Real F.X., Perucho M.

Comparative analysis of mutations in the p53 and K-ras genes in pancreatic cancer.

Int. J. Cancer 58:185-191(1994)