FTC-133细胞培养方法和应用介绍

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞背景简介

人甲状腺癌细胞源自一名42岁患有滤泡状甲状腺癌的男性的淋巴结转移灶。表达甲状腺球蛋白、EGFR，P53突变。碘131辐射可使FTC-133细胞摄碘能力下降。

FTC-133人甲状腺癌细胞系 是一种由扁平多边形变为梭形的甲状腺癌细胞系。这些细胞保留了分化的甲状腺细胞功能和甲状腺细胞对甲状腺素和局部活性生长因子的反应。此外，甲状腺球蛋白免疫反应也可见于这种细胞系。

FTC-133人甲状腺癌细胞系是一种来源于人甲状腺癌的肿瘤细胞系。这种细胞系已经被广泛应用于甲状腺癌的研究中，包括肿瘤发生机制、药物筛选和治疗等方面。

FTC-133人甲状腺癌细胞系通常通过将人甲状腺癌组织中的肿瘤细胞分离出来，经过体外培养和传代，最终得到稳定的细胞系。这些细胞具有多向分化潜能，可以分化为甲状腺上皮细胞、滤泡细胞和髓样细胞等不同类型的细胞。

由于FTC-133人甲状腺癌细胞系具有高度的增殖能力和分化能力，因此被广泛应用于甲状腺癌的研究中。

FTC-133细胞形态特征

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞产品信息

细胞名称：FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞

细胞别称：FTC-133; FTC133; 人甲状腺癌细胞

种属来源：人，42岁

组织来源：甲状腺

形态特性：贴壁生长，上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X,X;CSF1PO：10,10;D12S391：21,22;D13S317：11,11;D16S539：11,11;D18S51：11,11;D19S433：12,13;D21S11：32.2,32.2;D2S1338：20,20;D3S1358：15,15;D5S818：12,12;D6S1043：19,19;D7S820：9,10;D8S1179：10,10;FGA：21,21;Penta E：13,13;TH01：9.3,9.3;TPOX：9,9;vWA：15,18;

保藏机构：ECACC; ICLC; 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心

培养基：90%1640+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：1640基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞复苏步骤

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLFTC-133细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将FTC-133细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定FTC-133细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞传代操作

从培养箱拿出FTC-133细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当FTC-133细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有FTC-133细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定FTC-133细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞冻存准备

从培养箱拿出FTC-133细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在FTC-133细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

FTC-133人滤泡状甲状腺癌细胞应用

人甲状腺癌细胞可以用于甘露糖结合凝集素对甲状腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达影响的研究

用不同浓度的甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)分别作用于甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133),采用4-甲基偶氮四唑蓝(MTT法)检测细胞增殖,选择适量的浓度及作用时间,应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡,蛋白印记法(Western blot)检测两种癌细胞中Bcl-2和p53蛋白表达,探讨MBL与甲状腺肿瘤细胞增殖、凋亡的关系,为MBL用于防治甲状腺肿瘤提供理论依据。

方法

1. 细胞培养:人甲状腺乳头状癌(K1)和甲状腺滤泡状癌(FTC-133)细胞,分别培养于含有10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素、DMEM:F12:MCDB105(2:1:1)和DMEM-F12(1:1)的培养基中,37℃、5%CO2培养箱培养,23天换液1次。用0.25%胰酶常规消化传代,取对数生长期细胞进行实验。

2. MTT法检测细胞增殖:分别将甲状腺乳头状癌细胞(K1)、甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)与不同浓度的MBL(浓度分别为0、0.01、0.1、1、10ug/ml,每个浓度设5个复孔,0ug/LMBL为对照组)共培养12、24、48h后,MTT细胞增殖试验检测MBL对两种细胞生长的影响。

3. 流式细胞术检测细胞凋亡率:将甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)分别与0、1ug/mlMBL共培养48h后,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法观察MBL对两种甲状腺癌细胞凋亡的影响。

4. Bcl-2及p53基因蛋白表达的测定:提取实验组与对照组细胞中的总蛋白,以β-actin作为内参,蛋白印记法(Western blot)测定1ug/mlMBL分别作用于甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)48h后,Bcl-2及p53基因蛋白的相对表达量。

结果

1. MTT法检测结果:MBL作用于甲状腺乳头状癌及甲状腺滤泡状癌细胞后,各组细胞生长均受到抑制,并呈剂量、时间依赖关系。

2. 流式细胞术检测细胞凋亡率:MBL作用于甲状腺乳头状癌(FTC-133)及甲状腺滤泡状癌细胞(K1),检测到明显的凋亡峰,1ug/ml的MBL作用48h后甲状腺乳头状癌细胞(FTC-133)凋亡率为(12.87±0.47)%,而未经MBL作用的对照组凋亡率为(5.15±0.52)%,二者差异具有统计学意义(p<0.05)。1ug/ml的MBL作用48h后甲状腺滤泡状癌细胞(K1)凋亡率为(9.36±0.35)%,而未经MBL作用的对照组凋亡率为(3.24±0.71)%,二者差异具有统计学意义(p<0.05)。

3. Bcl-2及p53基因蛋白表达的测定

3.1 Bcl-2蛋白的相对表达量

3.1.1甲状腺乳头状癌细胞(K1):Western blot结果显示26KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.20±0.07),实验组为:(0.59±0.04),实验组与对照组相比Bcl-2蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.1.2甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133):Western blot结果显示26KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.07±0.11),实验组为:(0.33±0.06),实验组与对照组相比Bcl-2蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.2 p53蛋白的相对表达量

3.2.1甲状腺乳头状癌细胞(K1):Western blot结果显示53KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.51±0.29),实验组为:(0.74±0.07),实验组与对照组相比p53蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.2.2甲状腺滤泡状癌(FTC-133):Western blot结果显示53KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(0.88±0.14),实验组为:(0.35±0.08),实验组与对照组相比p53蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

结论

1. MBL在体外具有抑制甲状腺乳头状癌细胞及甲状腺滤泡状癌细胞增殖的作用,这种作用与剂量、时间呈正相关。

2. MBL在体外可促进甲状腺乳头状癌细胞及甲状腺滤泡状癌细胞凋亡,为以后MBL用于甲状腺癌防治提供理论基础。

3. MBL可诱导甲状腺癌细胞凋亡、抑制其增殖,在其诱导甲状腺癌细胞凋亡、促进其增殖的的过程中,Bcl-2和p53可能发挥着一定的作用。

FTC-133人甲状腺癌细胞系可以用于SLC27A2/FATP2在分化型甲状腺癌增殖和迁移中的作用及机制研究

探讨DUSP5介导FTC-133人甲状腺癌细胞系迁移增殖作用人甲状腺滤泡癌细胞系(FTC-133)分为以下4组:A:DUSP5过表达质粒转染FTC-133(DUSP5);B:空载对照质粒转染FTC-133(NC);C:DUSP5小干扰转染FTC-133(siDUSP5);D:空载对照小干扰转染FTC-133(siNC)。western blotting和qRT-PCR检测DUSP5的干预效果。根据Transwell检测细胞迁移、侵袭能力,EdU检测细胞增殖能力,western blotting检测迁移相关蛋白分子的表达情况。

KEGG富集分析明确FTC与PTC差异基因所富集关键通路并进行体外验证进一步通过对三个数据集差异表达基因进行KEGG富集分析发现,MAPK信号通路在三个数据集中均富集显著,提示我们MAPK信号通路在介导FTC与PTC生物学行为差异方面发挥重要作用。我们分别应用MAPK信号通路中三个亚通路的抑制剂以Edu、Transwell验证三个亚通路(ERK MAPK,JNK,p3 8 MAPK)在FTC细胞中发挥的作用。进一步以western blotting检测干预DUSP5的表达后MAPK信号通路的三个亚通路的激活情况,随后Edu、Transwell明确DUSP5与其激活的MAPK亚通路对FTC-133人甲状腺癌细胞系细胞增殖、迁移以及侵袭的影响。

统计学分析统计学分析:数据以均数±标准差(mean±SE)表示,使用SPSS 22.0统计软件进行统计分析,两组间数据的比较使用非配对t检验。若P<0.05,则认为有统计学意义(双侧),若P<0.01,则认为有显著统计学意义(双侧)。

研究结果

1. 数据库综合分析结果:GEO数据库筛选发现GSE27155,GSE53157和GSE29315三个数据集符合纳入标准,共包含26个FTC样本,67个PTC样本,经GEO2R工具进行差异表达基因分析并以Venn进行汇总(图1.2),发现有26个基因(见表1)在这三个数据库中均差异表达。这26个差异表达基因中有2个在FTC中表达上调,24个表达下调(图1.3)。对26个共同差异表达基因以cBioPartol数据库中甲状腺癌病人的临床资料进行生存相关分析,我们发现这26个共同差异表达基因中DUSP5对于甲状腺癌的生存率有明显的影响(图1.4)。

2. 验证病理组织DUSP5的表达情况:免疫组化结果显示,在FTC病理组织中DUSP5表达较少,而PTC病理组织中DUSP5大量表达(P<0.05)。在组织芯片中也得到相同的结果(P<0.05)。

3.细胞转染DUSP5:转染DUSP5过表达质粒、小干扰以及对应空白对照于FTC-133人甲状腺癌细胞系细胞,western blottingting、RT-PCR验证转染效果,结果显示:与空载对照质粒组相比,过表达质粒组DUSP5在蛋白水平和mRNA水平均表达增加(P<0.05),小干扰与对照组相比DUSP5表达降低(图3.1)(P<0.05)。

参考文献

[1]The impact of p53 and p73 on aneuploidy and cancer[J].Richard Tomasini;;Tak W.Mak;;Gerry Melino.Trends in Cell Biology,2008(5)

[2]A mannose-binding lectin from Sophora flavescens induces apoptosis in HeLa cells[J].Zhen Liu;;Bo Liu;;Zi-Ting Zhang;;Ting-Ting Zhou;;He-Jiao Bian;;Ming-Wei Min;;Yan-Hong Liu;;Jing Chen;;Jin-Ku Bao.Phytomedicine,2008(10)

[3]Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy[J].Isabel Marzo;;Javier Naval.Biochemical Pharmacology,2008(8)

[4]MBL2 and MASP2 gene polymorphisms in patients with hepatocellular carcinoma[J].L.Segat;A.Fabris;L.Padovan;M.Milanese;D.Pirulli;F.Lupo;M.Salizzoni;A.Amoroso;S.Crovella.Journal of Viral Hepatitis,2008(5)

[5]韩颖.甘露糖结合凝集素对甲状腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达影响的研究[D].河北医科大学,2011.

[6]Ghrelin promotes human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation through PI3K/Akt/mTOR/P70S6K and ERK signaling pathways.Jianhua Zhu;;Jianfeng Yao;;Rongfu Huang;;Yueqin Wang;;Min Jia;;Yan Huang.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2018

[7]New WHO classification of thyroid tumors:A pragmatic categorization of thyroid gland neoplasms.JoséManuel Cameselle-Teijeiro;;Manuel Sobrinho-Simões.Endocrinología,Diabetes y Nutrición(English ed.),2018

[8]Prognostic markers in well differentiated papillary and follicular thyroid cancer(WDTC).S.L.Gillanders;;J.P.O'Neill.European Journal of Surgical Oncology,2018

[9]Synergistic inhibition of ovarian cancer cell growth by combining selective PI3K/mTOR and RAS/ERK pathway inhibitors.Karen E.Sheppard;;Carleen Cullinane;;Katherine M.Hannan;;Meaghan Wall;;Joanna Chan;;Frances Barber;;Jung Foo;;Donald Cameron;;Amelia Neilsen;;Pui Ng;;Jason Ellul;;Margarete Kleinschmidt;;Kathryn M.Kinross;;David D.Bowtell;;James G.Christensen;;Rodney J.Hicks;;Ricky W.Johnstone;;Grant A.McArthur;;Ross D.Hannan;;Wayne A.Phillips;;Richard B.Pearson.European Journal of Cancer,2013

[10]张倩.DUSP5介导甲状腺滤泡癌恶性生物学行为及相关机制研究[D].山东大学,2021.