OCM-1A细胞培养操作方法和应用研究

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞背景简介

OCM-1A细胞系，人脉络膜黑色素瘤细胞具有高度增殖能力和侵袭性，能够迅速扩散到周围组织和远处器官。因此，它被广泛用于评估抗肿瘤药物的疗效和毒性，以及开发新型的抗肿瘤治疗方法。此外，OCM-1A细胞系也被用于研究肿瘤发生和发展的机制，以及探索新的靶点和治疗方法。

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞产品信息

细胞名称：OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞

细胞别称：OCM1A; OCM1a; 人低侵袭性脉络膜黑色素瘤

种属来源：人

组织来源：皮肤

形态特性：贴壁生长，上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11;D2S1338：19;D3S1358：14,16;D5S818：11,12;D7S820：8,10;D8S1179：13;D13S317：12;D16S539：9;D18S51：13,18;D19S433：14,15;D21S11：30;FGA：21;TH01：6,7;TPOX：8,11;vWA：18

保藏机构：cancercelllines; CVCL_6935

培养基：DMEM+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞培养操作方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞复苏步骤

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLOCM-1A细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将OCM-1A细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定OCM-1A细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞传代方法

从培养箱拿出OCM-1A细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当OCM-1A细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有OCM-1A细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定OCM-1A细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞冻存准备

从培养箱拿出OCM-1A细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

细胞冻存步骤

a.收集OCM-1A细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据OCM-1A细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在OCM-1A细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

OCM-1A人眼脉络膜黑色素瘤细胞应用

OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞可以用于miR-200c/Zeb1负反馈回路对眼内肿瘤上皮间质转化及成瘤性的作用

研究microRNA-200c与Zeb1构成的双向负反馈调节通道对眼内恶性肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)、成瘤能力及迁徙转移能力的调控作用。

方法

①miR-200c对眼内肿瘤上皮间质转化及迁徙能力的调控。①建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。应用miR-200c的模拟物和抑制剂对人眼脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1、人视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB1和Y79进行瞬时转染,在三个细胞株中建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。通过对miR-2O0c载体所携带的FAM荧光对转染后的细胞内的荧光表达情况进行荧光显微镜下的肉眼观察,初步评估转染效率。应用实时定量PCR对转染前后各株细胞中miR-200c的表达水平进行检测进一步评估转染效率。

②miR-200c对其靶基因——上皮间质转化过程的重要转录因子Zeb1的调节作用。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法对OCM-1、WERI-RB1和Y79细胞miR-200c转染前后细胞内的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表达进行检测,以验证miR-200c在眼内肿瘤对Zebl的调控作用。

③miR-200c对眼内肿瘤细胞上皮-间质转化的调控。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法,对三个细胞株miR-200c转染前后细胞内上皮标记因子E-cadherin、间质标记因子Vimentin和N-cadherin分别进行不同表达水平的定性、定量和定位,以检验miR-200c对上皮-间质转化因子的调控作用。

④miR-200c对眼内肿瘤细胞体外迁徙能力的调控。利用Transwell小室对OCM-1和Y79细胞各组(未转染组、空白对照转染组、模拟物WERI-RB1转染组、抑制剂转染组)进行体外透膜迁徙能力检测,以评估的表达干扰对眼内肿瘤细胞运动能力的作用。

参考文献

[1]miR-200c Inhibits Melanoma Progression and Drug Resistance through Down-Regulation of Bmi-1.Shujing Liu;;Michael T.Tetzlaff;;Rutao Cui;;Xiaowei Xu.The American Journal of Pathology,2012

[2]EMT-activating transcription factors in cancer:beyond EMT and tumor invasiveness.Ester Sánchez-Tilló;Yongqing Liu;Oriol Barrios;Laura Siles;Lucia Fanlo;Miriam Cuatrecasas;Douglas Darling;Douglas Dean;Antoni Castells;Antonio Postigo.Cellular and Molecular Life Sciences,2012

[3]ZEB/miR‐200 feedback loop:At the crossroads of signal transduction in cancer.Louise Hill;;Gareth Browne;;Eugene Tulchinsky.Int.J.Cancer,2012

[4]Cancer Invasion and the Microenvironment:Plasticity and Reciprocity.Peter Friedl;;Stephanie Alexander.Cell,2011

[5]邵晓蕾.miR-200c/Zeb1负反馈回路对眼内肿瘤上皮间质转化及成瘤性的作用[D].中南大学,2013.