CAL27细胞培养操作方法,形态特征及培养基介绍

CAL27细胞背景简介

CAL-27细胞是1982年由J.Gioanni(法国尼斯塞德克斯安托万·拉卡萨涅中心)从一位56岁的白人男性舌中部病变患者治疗前的组织中分离出来的上皮细胞，是一种非整倍体细胞，染色体模式数43。CAL-27细胞是上皮性的多边形细胞，胞质高度颗粒状，细胞角蛋白强阳性。CAL-27细胞细胞在半固态培养基中生长不好。CAL-27细胞在VP16(依托泊苷)、CCNU(1-[2-氯乙基]-3-环己基-1-亚硝基脲)、VM26(替尼泊苷)、ADM(阿霉素)、CPA(环磷酰胺)和MTX(甲氨蝶呤)存在下，观察到胸腺嘧啶掺入的显著抑制。CAL 27细胞对VDS(硫酸长春地辛)、CDP(顺式铂)或ACTD(放线菌素D)的治疗有抗性。1993年12月提交给ATCC的培养物被发现被支原体污染，通过用BM Cycline治疗21天治愈后代。CAL-27细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。

细胞对硫酸长春地辛(VDS)、顺铂(CDP)和放线菌素D(ACDD)等药物有耐药性，是口腔鳞状细胞癌(OSCC)研究领域最常用的细胞系之一。然而有研究发现，通过肿瘤形成试验、HE染色和免疫组化实验证明CAL-27异种移植物在体内生长缓慢，肿瘤表面和更深区域均形成囊泡，其生长模式更偏向口腔腺鳞癌。

Cal-27细胞具有高度颗粒状的细胞质，在半固体培养基中无法正常生长。该细胞是个合适的转染宿主，染色体模式为非整倍体，染色体数为43。在裸鼠体内可成瘤，皮下接种2×10^6个细胞，6周内可发展为实体瘤。

CAL-27细胞形态特征

Cal-27细胞呈上皮细胞样，贴壁生长，细胞具有高度颗粒状的细胞质常用在口腔鳞状细胞癌相关研究上。

CAL-27人舌鳞癌细胞产品信息

细胞名称：CAL-27人舌鳞癌细胞

细胞别称：Cal-27; CAL 27; Cal 27; CAL27; Cal27; Centre Antoine Lacassagne-27;人舌鳞癌细胞

种属来源：人

年龄性别：男;56岁

组织来源：舌

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10，12;D13S317：10，11;D16S539：11，12;D18S51：13;D19S433：14，15.2;D21S11：28，29;D2S1338：23，24;D3S1358：16;D5S818：11，12;D7S820：10;D8S1179：13，15;FGA：21，25;TH01：6，9.3;TPOX：8;vWA：14，17;

保藏机构：ATCC; CRL-2095 DSMZ; ACC-446;中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心

培养基：90%DMEM+10%FBS+P/S

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

染色体：43，异倍体

倍增时间：~20-45 hours

致瘤性：Yes, solid tumors developed within 6 weeks in nude mice inoculated with 2×10^6 cells subcutaneously.

CAL-27细胞培养操作方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

CAL-27人舌鳞癌细胞复苏方法

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLCAL-27细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将CAL27细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定CAL-27细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

CAL-27人舌鳞癌细胞传代操作

从培养箱拿出CAL-27细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当CAL-27细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有CAL-27细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定CAL-27细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

CAL-27人舌鳞癌细胞冻存准备

从培养箱拿出CAL-27细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

CAL-27细胞冻存方法

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在CAL-27细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

CAL-27人舌鳞癌细胞应用

探讨YAP对口腔鳞癌细胞CAL27的增殖和凋亡的影响,并研究其在体内体外促肿瘤的作用和机制,为YAP基因作为口腔鳞癌治疗新的靶点提供理论依据。

实验方法

1.用免疫组化法检测不同分化程度的口腔鳞癌和正常口腔上皮组织中YAP蛋白的表达情况。

2. 检测YAP在4株口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,并选择CAL27作为进一步的实验材料。利用慢病毒载体转染CAL27细胞,分别构建敲除和过表达YAP基因及对照组的口腔鳞癌细胞系。通过QRT-PCR及Western blot检测敲除和过表达效率。

3. 利用CCK-8细胞活力实验,EdU染色法,克隆形成实验来检测敲除和过表达YAP对CAL27细胞增殖的影响;流式细胞术检测YAP对细胞周期和细胞凋亡的影响。通过QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC、BCL-2等周期和凋亡相关因子随YAP表达改变时的情况。

4. 以不同浓度的Hippo-YAP信号通路抑制剂维替泊芬处理CAL27细胞,利用CCK-8细胞活力实验、流式细胞术来检测细胞增殖、凋亡和周期的改变;利用QRT-PCR及Western blot技术检测C-MYC和BCL-2等因子随抑制剂浓度改变情况。

5. 利用裸鼠成瘤实验,将敲除组、过表达组及相应对照组CAL27细胞注入到裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况,分析YAP的不同表达水平对口腔鳞癌发生发展的影响。

实验结果

1.YAP蛋白在正常口腔上皮组织中基本不表达,或表达较弱;口腔鳞状细胞癌中,YAP蛋白的表达水平较高,与肿瘤分化程度有关。

2. 在CAL27细胞中,YAP基因和蛋白表达水平适中。在敲除YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显降低,同时细胞中总YAP和细胞核中YAP表达水平均降低。过表达YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表达水平明显升高,而细胞中总YAP和胞核中YAP表达水平均升高。

3.与对照组相比,敲除YAP基因后,CAL27细胞增殖较慢,细胞周期阻滞,同时早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均升高;C-MYC和BCL-2mRNA及蛋白表达水平均降低;周期相关蛋白CyclinD1表达水平下降,促凋亡蛋白BAX、Caspase7表达水平升高。过表达YAP基因后,CAL27细胞增殖加快,细胞周期进展加速,早、晚期凋亡细胞比例均降低;C-MYC和BCL-2表达水平升高;CyclinD1蛋白表达水平升高,BAX、Caspase7蛋白表达水平下降。

参考文献

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