tu212细胞用什么培养基,培养操作方法,应用研究

TU212人喉癌细胞简介

TU212人喉癌细胞源自喉上皮癌，近几年的国际报道显示，这株细胞与T404、T406、Tu 138、Tu 158LN、Tu 159、Tu 182等细胞，为同一种细胞。TU212细胞常用于药物治疗喉癌的机制研究。

TU212细胞形态特征

TU212来源于头颈鳞癌，呈上皮细胞样，铺路石状，贴壁生长。常用于肿瘤增殖、侵袭、迁徙和凋亡实验，也适合转染RNA，研究喉癌的发展机制。

TU212人喉癌细胞产品信息

细胞名称：TU212人喉癌细胞

细胞别称：Tu-212; Tu212; TU212; 人喉癌细胞

种属来源：人

组织来源：头颈鳞癌

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：12,13;D5S818：12;D7S820：10;D13S317：12;D16S539：8,9;TH01：8;TPOX：10,11;vWA：15,16

培养基：90%IMDM+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

TU212人喉癌细胞培养操作方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：IMDM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

TU212人喉癌细胞复苏步骤

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLTU212细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将TU212细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定TU212细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

TU212人喉癌细胞传代操作

从培养箱拿出TU212细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当TU212细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有TU212细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定TU212细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

TU212人喉癌细胞冻存准备

从培养箱拿出TU212细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

TU212人喉癌细胞冻存方法

a.收集细胞及TU212细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据TU212细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在TU212细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

TU212人喉癌细胞应用

人喉表皮样癌细胞可以用于miR-362-3p在喉癌中表达和影响喉癌细胞迁移作用机制的初步研究。

运用相关分子生物学技术检测miR-362-3p在喉癌中表达水平、临床意义及其对喉癌细胞迁移侵袭能力的影响,预测miR-362-3p的潜在靶基因ALDOA,研究其是否通过ALDOA参与喉癌细胞的迁移侵袭,为寻找喉癌早期诊断和预后判断生物标志物提供线索。

实验材料

1、细胞系:人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系、人胚肾HEK293细胞、人咽鳞癌细胞系FADU、人喉癌细胞TU212。

2、组织标本:收集2015年1月至2017年11月新鲜喉癌及相应癌旁正常组织标本50例,术后立即将组织置-80℃冰箱保存。所有组织标本均经病理医生证实,并获得患者相关临床资料信息。经中国医科大学医学伦理委员会批准,并获得患者知情同意。

实验方法

1、细胞培养；

2、基因瞬时转染实验；

3、qRT-PCR检测；

4、Western blot检测；

5、细胞划痕实验；

6、Transwell小室检测法；

7、临床资料分析；

8、统计分析。

实验结果

1、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.05);同时,miR-362-3p在喉癌Hep2细胞中的表达水平较HEK293细胞显著升高(P<0.05)。提示miR-362-3p在喉癌中可能发挥癌基因作用。

2、单因素方差分析结果显示,与对照组相比,miR-362-3p在淋巴结转移和较高级别临床分期的喉癌患者癌组织中表达水平显著上调(P<0.05),而在不同年龄、性别、分化程度和浸润深度癌组织中表达水平无显著差异(P>0.05),提示miR-362-3p与喉癌的恶性程度有关。

3、qRT-PCR结果显示,miR-362-3p在转染miR-362-3p mimic或miR-362-3p inhibitor的Hep2细胞中表达水平较对照组(nc)分别显著升高或降低(P<0.05),证明转染成功。Transwell小室检测和细胞划痕实验结果表明,miR-362-3p mimic转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著增加(P<0.05),miR-362-3p inhibitor转染组中Hep2细胞迁移数量和迁移距离较对照组(nc)显著减少(P<0.05),提示miR-362-3p促进Hep2细胞迁移。

参考文献

[1]Antiproliferative potential of miR‐33a in laryngeal cancer Hep‐2 cells via targeting PIM1[J].Omer Faruk Karatas PhD.Head&Neck,2018(11)

[2]Long noncoding RNA CASC2 regulates hepatocellular carcinoma cell oncogenesis through miR‐362‐5p/Nf‐κB axis[J].Liang Zhao;;Yongjian Zhang;;Yubao Zhang.Journal of Cellular Physiology,2018(10)

[3]Aldolase A as a prognostic factor and mediator of progression via inducing epithelial–mesenchymal transition in gastric cancer[J].Zhonghua Jiang;;Xiaohong Wang;;Jing Li;;Hongmei Yang;;Xin Lin.Journal of Cellular and Molecular Medicine,2018(9)

[4]Roles of Aldolase Family Genes in Human Cancers and Diseases[J].Yu-Chan Chang;;Yi-Chieh Yang;;Chia-Ping Tien;;Chih-Jen Yang;;Michael Hsiao.Trends in Endocrinology&Metabolism,2018

[5]赵越.miR-362-3p在喉癌中表达和影响喉癌细胞迁移作用机制的初步研究[D].中国医科大学,2019.