CNE2细胞形态,培养步骤,研究应用

CNE2人鼻咽癌细胞背景介绍

CNE2人鼻咽癌细胞，来源于低分化鳞状癌细胞，是一种EB病毒(EBV)呈阴性的鼻咽癌(NPC)细胞系，最初认为起源于一名患有鼻咽癌的68岁男性，患者鼻咽部脱落细胞的细胞学检查和抗补体免疫酶检测分别显示低分化癌和EB核抗原阳性(EBNA)。

因此CNE-2最初被认为是EBV阳性，可能在后续传代培养过程发生了EBV基因组丢失。之后有研究发现CNE-1和CNE-2的STR谱之间存在高度相似性，推测它们应该来自同个细胞系，并且两株细胞均存在部分HeLa的基因组，似乎为HeLa和未知来源细胞系的杂交种。

CNE-2常用于鼻咽癌相关的分子机制研究，有研究报道了一种新的“细胞内感染”机制，被EBV感染的Akata B细胞能够在体外入侵上皮CNE-2细胞,形成“cell-in-cell”结构，该结构的形成导致CNE-2细胞中出现EBV的基因表达和病毒颗粒。

CNE-2为上皮细胞样，贴壁生长，是一个合适的转染宿主。CNE-2的染色体数在87~107，并有许多标记染色体，其中包含两个巨大的染色体M1和M2。由于M1和M2是低分化鼻咽癌上皮细胞系中第一个被发现的标记染色体，它们的条带模式很明确，能引导更多科研工作者对鼻咽癌细胞系的遗传学研究。

CNE2人鼻咽癌细胞形态

CNE-2为上皮细胞样，贴壁生长，是一个合适的转染宿主，常用在鼻咽癌相关研究方面。

CNE2人鼻咽癌细胞产品信息

细胞名称：CNE2人鼻咽癌细胞

细胞别称：CNE-2; CNE2;人鼻咽癌细胞

种属来源：人

组织来源：鼻

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,11;D2S1338：17,23;D3S1358：15,18;D5S818：11,12;D7S820：10,12;D8S1179：12,17;D13S317：10,12,13.3;D16S539：9,10;D18S51：13,16;D19S433：13;D21S11：27,30;FGA：18,21;TH01：6,7,9;TPOX：8,9,12;vWA：14,16

保藏机构：CCTCC; GDC0155

培养基：90%DMEM+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

CNE2人鼻咽癌细胞培养操作方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1.无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2.仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3.器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

4.试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1.无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

CNE2人鼻咽癌细胞复苏步骤

1)准备：紫外线照台30min，提前打开水浴锅设置37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20分钟(或者放在超净工作台常温放30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL移液枪，3mL巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1mLCNE2细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞1min内融化，加4mL培养基混合均匀，移入离心机中100rpm离心3min，以75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用3mL巴氏管取5mL新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取12mL新鲜培养基到一个新的10cm培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将CNE2细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定CNE2细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

CNE2人鼻咽癌细胞传代操作

从培养箱拿出CNE2细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当CNE2细胞状态良好，且密度达到85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取4ml不含钙、镁离子的1xPBS(6cm皿)到细胞培养皿中(若是10cm皿则取8ml1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走PBS废液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO2培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用1ml移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸1ml移液枪移入无菌离心管中。

将装有CNE2细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000转离心3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取1-2mL新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画30个8字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定CNE2细胞已铺匀后，再把培养皿放入CO2培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

CNE2人鼻咽癌细胞冻存准备

1)准备工作：紫外线照台30min，准备好CNE2细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出CNE2细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25瓶为例

CNE2细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在CNE2细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的培养基)。

c.将冻存管入库到-80度冻存盒里，放置24小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

CNE2人鼻咽癌细胞应用

人鼻咽癌细胞是一种来源于人类鼻咽癌组织的恶性细胞。这些细胞在实验室条件下可以进行培养和研究，以深入了解鼻咽癌的生物学特性、发生机制以及潜在的治疗方法。

人鼻咽癌细胞的研究对于理解鼻咽癌的发病机理、预防和治疗策略的制定具有重要意义。通过对这些细胞的研究，科学家们可以探索鼻咽癌细胞的生长、增殖、转移和耐药性等特性，以及寻找新的治疗靶点和药物。

在实验室中，人鼻咽癌细胞通常通过细胞培养技术进行培养和繁殖。科学家们使用特定的培养基和条件，模拟体内的环境，以促进细胞的生长和增殖。通过这些细胞培养实验，可以观察细胞的形态、生长速度、对药物的敏感性等指标，以评估鼻咽癌的生物学特性和治疗效果。

人鼻咽癌细胞可以用于芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期的影响

将不同浓度的芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)作用于人鼻咽癌细胞CNE2,通过MTT法、流式细胞术检测芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期分布的影响,为芦荟大黄素的临床应用提供实验依据。

方法

通过MTT法(又称MTT比色法)和流式细胞术等体外实验观察不同浓度芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期分布的影响。

(1) MTT法:将不同浓度的芦荟大黄素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌细胞CNE2,分别培养24h,48h,72h,观察芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2增殖的影响。

(2) 流式细胞术:将不同浓度的芦荟大黄素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌细胞CNE2 48h,观察芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2凋亡和周期分布的影响。

结果

(1)MTT法:不同浓度的芦荟大黄素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌细胞CNE2 24h,48h,72h后,细胞增殖抑制率随着药物浓度和作用时间的增加也相应增加,并在40ug/ml时达到平台期,各实验组与空白组相比P<0.05,具有显著统计学意义。结果表明:芦荟大黄素在(2.5ug/ml40ug/ml)时能抑制人鼻咽癌细胞CNE2的增殖,并呈时间和浓度依赖性。

(2)流式细胞术检测细胞凋亡:将不同浓度的芦荟大黄素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌细胞CNE2 48h,实验结果显示:随着药物浓度的增加,凋亡率从1.153%依次增加至3.753%,与空白组相比P<0.05,具有显著统计学意义。表明芦荟大黄素作用48h时,人鼻咽癌细胞CNE2凋亡率明显增加,并呈浓度依赖性。

(3)流式细胞术检测细胞周期:将不同浓度的芦荟大黄素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌细胞CNE2 48h,实验结果显示:在G2/M期,与AE0ug/ml组相比,其余各组G2/M期细胞比例均明显增加。表明芦荟大黄素作用48h时,能将人鼻咽癌细胞CNE2周期阻滞在G2/M期。

结论

1.芦荟大黄素能抑制人鼻咽癌细胞CNE2的增殖,并呈时间和浓度依懒性。

2. 芦荟大黄素作用48h时,人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡率从整体上看凋亡基数不高,但是仍具有依次增加的趋势,尤其是早期凋亡率具有显著的浓度依赖性。

3.芦荟大黄素作用48h时,能将人鼻咽癌细胞CNE2周期阻滞在G2/M期。

参考文献

[1]Chemical constituents of Aloe barbadensis Miller and their inhibitory effects on phosphodiesterase-4D[J].Jiasheng Zhong;;Yiyou Huang;;Wenjing Ding;;Xiaofang Wu;;Jinzhi Wan;;Haibin Luo.Fitoterapia,2013

[2]Dietary Aloe vera components’effects on cholesterol lowering and estrogenic responses in juvenile goldfish,Carassius auratus[J].Francesco A.Palermo;;Paolo Cocci;;Mauro Angeletti;;Alberto Felici;;Alberta Maria Polzonetti-Magni;;Gilberto Mosconi.Fish Physiology and Biochemistry,2013(4)

[3]The Effect of an Aloe Polymannose Multinutrient Complex on Cognitive and Immune Functioning in Alzheimer's Disease[J].John E.Lewis;;H.Reginald McDaniel;;Marc E.Agronin;;David A.Loewenstein;;Jorge Riveros;;Rafael Mestre;;Mairelys Martinez;;Niurka Colina;;Dahlia Abreu;;Janet Konefal;;Judi M.Woolger;;Karriem H.Ali.Journal of Alzheimer's Disease,2012

[4]Antiviral activity of Aloe hijazensis against some haemagglutinating viruses infection and its phytoconstituents[J].Howaida Abd-Alla;Nagat Abu-Gabal;Amal Hassan;Mounir El-Safty;Nagwa Shalaby.Archives of Pharmacal Research,2012(8)

[5]赵焱丽.芦荟大黄素对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期的影响[D].河南中医药大学,2018.