Bt474细胞用什么培养基,形态特点及注意事项

BT-474人乳腺导管癌细胞简介

BT-474细胞是由E·Lasfargues和W·G·Coutinho从一名60岁白人女性乳腺癌患者实心的乳腺浸润性导管癌中分离到的细胞株。BT-474[BT474]细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。

BT-474人乳腺导管癌细胞形态特征

BT-474细胞呈岛状/片状生长：这是该细胞的特性，是正常现象，并不是细胞发生“聚团”，无需担心。

BT-474人乳腺导管癌细胞产品信息

细胞名称：BT-474，人乳腺导管癌细胞

细胞别称：Bt-474; BT474;人乳腺导管癌细胞

种属来源：人

年龄性别：女;60岁

组织来源：乳腺，乳房 ;乳腺导管癌

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10，11;D13S317：11;D16S539：9，11;D18S51：13，18;D19S433：14，17;D21S11：28，32.2;D2S1338：19;D3S1358：17;D5S818：11，13;D7S820：9，12;D8S1179：10，12;FGA：22，25;TH01：7;TPOX：8;vWA：15，16;

保藏机构：ATCC; CRL-7913 ATCC; HTB-20 BCRC; 60359 BCRJ; 0353 DSMZ; ACC-64 ;中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

培养基：RPMI-1640+10%FBS+1%PS+10ug/ml牛胰岛素(或重组人胰岛素)

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

倍增时间：84-100 hours

致瘤性：Yes, in Amsterdam/IMR rats with regression in 10 days. Yes, in nude mice.

BT-474人乳腺导管癌细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：RPMI-1640培养基、FBS胎牛血清、双抗、牛胰岛素(或重组人胰岛素)、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

BT-474人乳腺导管癌细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将BT474细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定BT474细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

BT-474人乳腺导管癌细胞传代操作

从培养箱拿出BT-474细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

将装有BT-474细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定BT-474细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

BT-474人乳腺导管癌细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好BT-474细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

bt474细胞冻存步骤

a.收集BT-474细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据BT-474细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

BT474细胞培养注意事项

bt474细胞呈岛状/片状生长：这是该细胞的特性，是正常现象，并不是细胞发生“聚团”，无需担心。细胞间连接紧密，在70%~80%密度时细胞实际数量其实比较大了，此时需要传代。

bt474细胞生长速度偏慢：注意控制传代密度不要过低，否则生长速度会极慢。推荐传代比例1:2-1:4(具体情况视细胞生长速度及密度决定)

黑点较多：bt474细胞培养时背景中可能有黑点，为细胞代谢产物和细胞碎片，不影响细胞生长。若黑点较多可以通过PBS润洗或换液清除。如果黑点较多同时出现细胞变形、大量死亡或不生长的情况，应该考虑操作不当导致细胞受损或者存在支原体污染。

存在漂浮细胞：bt474细胞培养时存在部分漂浮的细胞是正常现象，不影响贴壁细胞生长。

BT-474人乳腺导管癌细胞培养常见问题

1.BT474人乳腺导管癌细胞复苏之后贴壁很慢正常吗?

BT474细胞复苏后需要一定时间恢复状态，BT474细胞贴壁较慢，消化处理后48h内尽量不要移动，以免影响贴壁，生长速度较慢，培养过程中，有小部分细胞会漂在培养基中属于正常现象。

2.BT474传代密度多大?

BT474细胞容易抱团生长，因此不会长满整个皿，细胞密度达70%以上即可传代。

3.BT474细胞培养过程中有很多小黑点是正常的吗?

BT474细胞培养过程中会有碎片和分泌物是正常的。

4.BT474细胞一分二多久长满?

4天左右。

5.细胞呈岛状/片状生长正常吗？

这是BT474细胞的特性，是正常现象，并不是细胞发生“聚团”，无需担心。细胞间连接紧密，在70%~80%密度时细胞实际数量其实比较大了，此时需要传代。

6.BT474细胞生长速度偏慢？

注意控制传代密度不要过低，否则生长速度会极慢。推荐传代比例1:2-1:4(具体情况视细胞生长速度及密度决定)

7.BT474细胞培养时为什么会出现黑点较多的现象？

BT474细胞培养时背景中可能有黑点，为细胞代谢产物和细胞碎片，不影响细胞生长。若黑点较多可以通过PBS润洗或换液清除。如果黑点较多同时出现细胞变形、大量死亡或不生长的情况，应该考虑操作不当导致细胞受损或者存在支原体污染。

8.为什么会存在漂浮细胞？

Bt474细胞培养时存在部分漂浮的细胞是正常现象，不影响贴壁细胞生长。

BT-474人乳腺导管癌细胞应用

1.PNRC多肽通过干扰核受体途径抑制BT474细胞的增殖

目的

运用核受体辅活化子PNRC的抗Ras PTD融合多肽(PTD-PARP)研究其在乳腺癌细胞BT474中的分布,对核受体信号传导途径的影响及其抗肿瘤细胞增殖活性.

方法

用多肽合成仪合成PTD-PARP,单独的PARP和PTD多肽以及FTFC标记的PTD-PARP,PARP.HPLC分析和纯化后,荧光显微镜结合流式细胞仪检测PTD-PARP,PARP在BT474细胞中的分布.虫荧光素酶报告基因检测PTD-PARP对野生型PNRC辅活化ER反式激活功能的影响.MTS,软琼脂克隆形成实验检测PTD-PARP对BT474细胞的抗增殖活性.

结果

PTD-PARP能进入BT474细胞,抑制野生型PNRC辅活化ER的反式激活功能并抑制BT474细胞的增殖.

结论

PNRC抗RasP DT融合多肽可通过干扰核受体途径抑制乳腺癌细胞的增殖.

2.用于藏药毛诃子化学成分及体外抗癌活性的研究

总结了没食子酸及其酚酸类衍生物、鞣花酸及其酚酸类衍生物、可水解鞣质的质谱解析规律。采用CellTiter-Blue?Cell Viability Assay法,对藏药毛诃子不同极性萃取部位的抗癌活性进行初步评价。

选用人乳腺导管癌细胞(ZR 75-1)、人乳腺导管癌细胞(BT-474)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人乳腺癌细胞(T-47D)、人结肠直肠腺癌细胞(Colo-205)、人结肠腺癌细胞(HT-29)、人结肠癌细胞(SW480)、人子宫内膜腺癌细胞(Hec-1-A)、人前列腺癌细胞(LnCap)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)10种癌细胞为模型,比较藏药毛诃子不同极性部位的抗癌活性,结果表明,藏药毛诃子乙酸乙酯萃取部位和水萃取部位抗癌活性较强,乙酸乙酯萃取部位对ZR 75-1、Colo-205、BT-474和T-47D癌细胞的抑制作用最为明显,其半数抑制浓度IC50分别为27.33μg/mL、36.63μg/mL、5 0.67μg/mL和53.47μg/mL;

水萃取部位对T-47D和Colo-205癌细胞的抑制作用最为明显,其半数抑制浓度IC50分别为35.98μg/mL和55.17μg/mL。

选用人乳腺导管癌细胞(ZR75-1)和人结肠直肠腺癌细胞(Colo-205)为模型,对乙酸乙酯萃取部位分离得到的21个单体化合物进行抗癌活性筛选,结果表明诃,子宁、诃子酸、安石榴苷、柯里拉京、五没食子酰葡糖苷5个单体对ZR75-1癌细胞增殖有较强的抑制作用,且半数抑制浓度IC50分别为6.31 mM、7.48 mM、7.95mM、7.71 mM、25.23 mM;

诃子宁、诃子酸、安石榴苷、柯里拉京4个单体对Colo-205癌细胞增殖有较强的抑制作用,且半数抑制浓度IC50分别为6.04 mM、19.69mM、10.88 mM、7.58 mM。采用Annexin V-FITC/PI双标记法及流式细胞术研究检测乙酸乙酯萃取部位对其较为敏感的人乳腺导管癌细胞(ZR75-1)和人结肠直肠腺癌细胞(Colo-205)凋亡的影响,结果表明,毛诃子乙酸乙酯部位作用72 h对ZR75-1和Colo-205细胞具有显著的诱导凋亡作用,且随着药物浓度的增加,细胞总凋亡率逐渐上升。

bt474细胞参考文献

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The cells form adherent patches of epithelial-like cells The patches are compact multilayered colonies that rarely become confluent
 
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