bend3细胞怎么培养,形态描述,常见问题

Bend.3小鼠微血管内皮细胞简介

Bend.3，小鼠脑微血管内皮细胞。由哥伦比亚大学实验室从患有内皮瘤的BALB/c小鼠脑内皮细胞提取的细胞系，通过表达多瘤病毒中间T抗原的NTKmT逆转录病毒载体感染原代细胞实现了永生化。注射到小鼠体内可导致血管瘤形成。

经检测，Bend.3细胞表达内皮特异性蛋白如PECAM-1、Endoglin、MECA-32和Flk-1，使用炎性细胞因子如TNFα、IL-1和LPS可诱导蛋白ICAM-1、VCAM-1和CD62E的表达，并具有浓度和时间依赖性。同时检测发现细胞可表达血管假性血友病因子，摄取荧光标记的低密度脂蛋白(LDL)。

这些结果证实了Bend.3的内皮细胞性质。Bend.3细胞在神经科学方面的应用较为广泛，可以作为研究神经元迁移、神经元分化以及神经细胞毒性等问题的有力工具。此外，Bend.3细胞也被用于研究失眠、阿尔兹海默症、霍奇金病等神经退行性疾病，以及某些脑肿瘤的治疗策略和靶向药物的研发。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞用表达多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆转录病毒转染进行转化。观察到血管性血友病因子的表达及对荧光标记的低密度脂蛋白(LDL)的摄入确认其内皮细胞特性。bEnd.3 cells细胞可用细胞因子和脂多糖(LPS)诱导淋巴细胞的Peyer's结高内皮细胞受体，粘膜血管定居因子(MAdCAM-1) 及内皮细胞选择素的表达。肿瘤坏死因子 a (TNF alpha), 白介素 1 (IL-1)或 LPS的诱导作用是浓度及时间依赖的。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞形态特征

Bend.3为内皮细胞样，贴壁生长。部分细胞形态不一致，可能出现扁平状、上皮样，或者成纤维细胞样被拉长的细胞。大部分细胞贴在中间，当密度增高时，细胞形成一个更均匀的单分子层，并以漩涡状排列。与其他常被描述为鹅卵石样的内皮细胞相比，Bend.3细胞更加细长，有点像成纤维细胞。

Bend.3细胞生长过程中的细胞可能呈颗粒状，并产生碎片，同时也可产生大量活的漂浮细胞，因此培养过程中建议不要丢弃漂浮的细胞。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞产品信息

细胞名称：Bend.3，小鼠微血管内皮细胞

细胞别称：bEND.3; b.End3; Bend.3; bEnd3; brain-derived Endothelial cells.3;小鼠微血管内皮细胞

种属来源：BALB/c

年龄性别：6周龄

组织来源：脑微血管

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

保藏机构：ATCC; CRL-2299 BCRC; 60515 ECACC; 96091929

培养基：90%DMEM+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

倍增时间：~26-30小时

抗原表达情况：ICAM-1 +; VCAM-1 +; MAdCAM-1 +

基因表达情况：von Willebrand factor,ICAM-1 +; VCAM-1 +; MAdCAM-1 +,The endothelial nature of these cells was confirmed by the observed expression of von Willebrand factor and uptake of fluorescently labeled low density lipoprotein (LDL).,The expression of Peyer's Patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin (MAdCAM-1) and E-selectin can be induced on bEnd

bend3细胞怎么培养

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

Bend.3内皮细胞复苏操作

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内的Bend.3细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将BEND.3细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定BEND.3细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

BEND.3细胞传代操作

从培养箱拿出Bend.3细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个BEND.3细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对Bend.3细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

将装有Bend.3细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

确定Bend.3细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

BEND.3小鼠微血管内皮细胞传代小贴士

1. Bend.3细胞培养过程中形态多样，低密度时容易出现放射状细胞，看似已经铺满瓶底，其实细胞量较少，需要细胞胞体排列紧密的时候进行传代;

2. 培养过程中避免频繁换液，可以每隔2-3天换液或者半量换液一次;

3. 培养过程中会产生10%左右活的单颗漂浮细胞，贴壁细胞密度偏低时，注意收集悬浮细胞，贴壁细胞密度偏高时，可以换液时丢弃;

4. 接种量对细胞生长有影响，接种量过低细胞会有增殖缓慢，漂浮过多的现象，请注意控制传代比例;

5. Bend.3细胞对温度和pH较敏感，传代或换液前培养基可以常温复温4小时以上;避免使用pH改变(偏酸：颜色偏黄;偏碱：颜色偏紫红)的培养基;

6. Bend.3细胞传代过程中若出现单次消化时间过长，可进行分次消化，切不可将细胞强行吹下来，以避免吹打造成细胞机械损伤。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

Bend.3小鼠微血管内皮细胞冻存步骤

a.收集bend3细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度1×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在bend3细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞培养常见问题

1. BEND.3小鼠微血管内皮细胞易老化，传代几次细胞老化?

可能原因分析

1)消化时间问题，该细胞较易消化，培养箱内消化2~3分钟，但因细胞较薄，目测不易判断细胞是否消化完全，可镜下观察细胞是否回缩， 并用胰酶试吹一下。

2)细胞密度低时，形态较大，好似已铺满皿底，但细胞量并不多，如进行传代，细胞量低，生长缓慢，也造成老化假象。生长缓慢贴壁时间过长，造成细胞难消化时，需加长消化时间，不可暴力吹打。

2.Bend.3小鼠微血管内皮细胞形态多样化的问题，细胞形态不一致?

Bend.3细胞本身生长较慢，在低密度时会呈现不规则细胞形态，高密度时则呈规则纤维状，所以若在培养过程中发现细胞形态异常，则有可能是细胞密度低，建议细胞铺满密度较高时传代。Bend.3细胞密度较低时，细胞形态较大，部分细胞会出现“太阳花”样形态，这是细胞增殖的一个过程，为正常现象。

3. Bend.3细胞消化时间为多久?

Bend.3细胞培养时间越长越难消化，培养4天传代，一般消化3-5分钟；培养7天传代，一般消化5-10分钟。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。

4. Bend.3细胞难消化怎么办？

如遇到消化困难不必担心，可通过分次消化的方式解决，具体操作方法如下(以T25瓶细胞为例)：

1)吸出原培养液

2)加入2mL左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃;

3)加入1mL左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞;

4)放入培养箱消化，消化3-5分钟(根据具体细胞稍作延长或缩短)，显微镜下看到细胞开始漂浮，可以加入2mLPBS，晃动培养瓶使细胞悬浮，不要吹打剩下的贴壁细胞;

5)吸出培养瓶内的PBS和细胞悬液，转移到无菌离心管中，在离心管中加入3mL含血清的培养基终止消化并吹散细胞，使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液;

6)原培养瓶中加入0.5mL胰酶，晃动培养瓶浸润细胞，放入培养箱继续消化，直到细胞块中间全部收缩变圆，晃动培养瓶可脱落;

7)用3mL含血清的培养基终止消化，将瓶底的细胞全部吹下，并轻轻吹吸分散细胞呈单颗;

8)收集Bend.3细胞悬液与第一次消化下来的细胞合并到一个离心管;

9)离心收集细胞沉淀，1200rpm/min 3分钟，离心完吸出上清丢弃;

10)加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养;

11)检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。

5.Bend.3小鼠微血管内皮细胞是不是对血清要求比较高？

BEND.3细胞依赖高质量特级血清，对血清要求高。

6.Bend.3小鼠微血管内皮细胞培养过程中建议传代密度多大？

Bend.3细胞在培养过程中我们发现细胞状态一般时在密度低于50%时生长到80%约需要4-5天，建议在传代时尽量密度高于80%。

7.Bend.3小鼠微血管内皮细胞多久换一次液？

Bend.3细胞培养过程中避免频繁换液，可以每隔2-3天换液或者半量换液一次。

细胞文献溯源

1993年始，迄今为止，关于小鼠微血管内皮细胞(Bend.3)的文献已有364篇。

在pubmed数据库中用“Bend.3 cell line”搜索该关键词，第一篇为1993年E E Sikorski在J Immunol.发表的“The Peyer's patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin, is induced on a murine endothelial cell line by tumor necrosis factor-alpha and IL-1”。

Bend.3小鼠微血管内皮细胞应用领域

● 小鼠微血管内皮细胞(Bend.3)是从患有内皮瘤的小鼠脑组织中分离出来的内皮细胞。这些细胞在神经科学研究中具有重要的应用价值，因为它们在维持大脑的血液循环和神经血管单元的功能中起着关键作用。微血管内皮细胞作为血管壁的一部分，对于调节血液流动、炎症反应和神经元通讯都起着关键作用。

● 通过研究Bend.3，研究人员可以更好地其在正常和病理状态下的功能，有助于揭示神经退行性疾病、中风、癫痫等疾病的发病机制，并可能为开发新的治疗方法提供思路。

● Bend.3可以用于药物筛选和评估，帮助研究人员确定哪些药物可能对治疗与血管功能障碍相关的神经系统疾病有效。

● 研究人员可以利用Bend.3进行血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)的相关研究，如炎症和氧化应激对血脑屏障完整性的影响，这对于理解神经炎症性疾病和脑老化过程具有重要意义。

● Bend.3细胞还可以用于研究包括细胞损伤和凋亡、药物转运和代谢、信号传导和细胞保护、基因表达和表观遗传学机制，以及细胞模型建立。

bEnd.3细胞标志物

小鼠微血管内皮细胞Bend.3的标志物包括vWF、CD34、CD31、CD105、Flk-1、PECAM-1、VE-cadherin、ICAM-1、VCAM-1和CD62E等。这些标志物用于识别和研究内皮细胞的生物学特性和功能。

bEnd.3细胞参考文献

Montesano R, et al. Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell 62: 435-445, 1990. PubMed: 2379237

Sikorski EE, et al. The Peyer's patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin, is induced on a murine endothelial cell line by tumor necrosis factor-alpha and IL-1. J. Immunol. 151: 5239-5250, 1993. PubMed: 7693807

Williams RL, et al. Embryonic lethalities and endothelial tumors in chimeric mice expressing polyoma virus middle T oncogene. Cell 52: 121-131, 1988. PubMed: 3345558