Calu-3细胞培养条件,生长速度,形态特点及常见问题

Calu-3人肺癌细胞背景简介

Calu-3细胞是从一名25岁的白人男性肺腺癌患者的胸水中分离建系的；该患者曾使用过环磷酰胺、博来霉素、阿霉素进行治疗。

Calu-3表现出细支气管上皮的许多特征，是一种cAMP依赖性Cl-分泌的人气道上皮细胞系，可用于研究人类呼吸功能、结构和炎症反应的模型。有检测发现CALU-3有ErbB2基因的扩增，可表达组成型活性的ErbB2/Her2，以及野生型EGFR和突变型K-Ras (G13D)。此外，该细胞含有TP53和CDKN2A基因的突变，对药物埃罗替尼和西妥昔单抗敏感，而这两种药物是针对ErbB受体的常用药。

有研究表明Calu-3细胞可用于SARS-CoV-2的体外繁殖，是一种合适的转染宿主，在癌症和毒理学研究中具有广泛应用。CALU-3为上皮细胞样，贴壁生长。干系染色体数目为亚三倍体，正常的1、13、15和17号染色体缺失，X染色体为二倍体。可在裸鼠体内成瘤，形成分化良好的I级腺癌。

Calu-3人肺癌细胞形态特征

calu-3细胞形态呈上皮细胞样，贴壁生长，常用在人类呼吸功能、结构和炎症反应的模型研究上。

Calu-3人肺癌细胞产品信息

细胞名称：Calu-3，人肺癌细胞

细胞别称：CaLu-3; CALU-3; Calu 3; Calu3; CALU3;人肺腺癌细胞

种属来源：人

年龄性别：男;25岁

组织来源：肺;转移灶;胸水腺癌

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

染色体：56~63，XX，有若干染色体易位

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11，12;D13S317：12;D16S539：12，14;D18S51：14，17;D19S433：12，13;D21S11：28，30;D2S1338：19;D3S1358：15，18;D5S818：11;D7S820：10，11;D8S1179：11，15;FGA：25;TH01：6，9.3;TPOX：8;vWA：16，17;

保藏机构：ATCC; HTB-55 BCRJ; 0264

培养基：90%MEM+10% FBS+1%PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

倍增时间：~35-45 hours

致瘤性：Yes, forms well differentiated grade I adenocarcinoma in nude mice.

抗原表达情况：Blood Type A; Rh+

基因表达情况：Blood Type A; Rh+

Calu-3人肺癌细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul；蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：MEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

Calu-3人肺癌细胞复苏方法

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLCalu-3细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将Calu-3细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定Calu-3细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

Calu-3人肺癌细胞传代步骤

从培养箱拿出Calu-3细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

1.打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

2.用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化5-7min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入CO₂培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有Calu-3细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

4.将装有Calu-3细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5.确定Calu-3细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

Calu-3人肺癌细胞培养小贴士

1. Calu-3细胞不易消化，具体消化时间根据贴壁情况

2. Calu-3细胞贴壁较慢，建议处理后24h内不要移动，防止影响细胞贴壁。

3. Calu-3细胞易抱团，所以建议放培养箱静置消化5分钟以上。

4. Calu-3细胞生长较慢，是正常状态。

Calu-3人肺癌细胞冻存步骤

从培养箱拿出Calu-3细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

a.收集Calu-3细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据Calu-3细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

Calu-3人肺癌细胞培养常见问题

1.Calu-3人肺癌细胞复苏好几天都不贴壁？

Calu-3细胞贴壁时间较长，消化处理传代等操作后建议24h内尽量不要移动，防止影响细胞贴壁，该细胞生长速度较慢，属于正常现象。

2.Calu-3人肺癌细胞成团怎么办？

Calu-3细胞易抱团，建议放培养箱静置消化5分钟以上。Calu-3细胞不易消化，具体消化时间根据贴壁情况。

Calu-3人肺癌细胞特点

Calu-3细胞是一种人源性肺腺癌细胞系，其外观和形态具有独特的特点。在显微镜下观察，Calu-3细胞呈现出典型的肺腺癌细胞的形态特征。

Calu-3细胞是一种椭圆形或不规则形状的细胞，其大小约为10-15微米。细胞表面光滑，没有突起或伸展。细胞的质膜完整，没有明显的损伤或缺陷。

在细胞核方面，Calu-3细胞具有单个、圆形的细胞核。细胞核通常位于细胞的中央或稍微偏离中央位置。细胞核的直径约为7-10微米。细胞核的染色质呈现出均匀浓缩的状态，没有明显的凝聚或分散。

除了细胞核外，Calu-3细胞还具有丰富的细胞质。细胞质呈现出颗粒状的结构，在显微镜下观察，可以看到许多小颗粒弥散在细胞质中。这些颗粒可能是蛋白质、核酸或其他细胞器的组分。

Calu-3细胞的细胞间连接也是其形态的一个重要特点。细胞间连接是细胞膜上的一种结构，可以将相邻细胞紧密连接在一起。在Calu-3细胞中，细胞间连接显示出较强的粘附力，使细胞能够形成紧密的群体。

总的来说，Calu-3细胞具有典型的肺腺癌细胞形态特征，包括椭圆形或不规则形状的细胞、单个圆形的细胞核、丰富的细胞质和强大的细胞间连接。这些形态特征不仅对于研究肺腺癌的发生和发展具有重要意义，也为临床诊断和治疗提供了参考依据。

Calu-3人肺癌细胞应用

用于细胞膜仿生壳聚糖基纳米载体用于蛋白药物的肺给药治疗研究

以msFGFR2c作为包载的目的蛋白,通过离子交联法制备了载药纳米微粒PCCs/msFGFR2c,并以水溶性季铵盐壳聚糖HTCC构建HTCC/msFGFR2c为对照,测得PCCs/msFGFR2c和HTCC/msFGFR2c的粒径分别在190nm和210nm左右,相应表面电位分别在0.81mV和9.7mV左右。PCCs/msFGFR2c、HTCC/msFGFR2c的包封率分别在47.2%和27.19%左右,载药量分别在9.4%和5.8%左右。原子力显微镜和透射电镜显示纳米粒子形态为类球型。

体外释药试验得出:在24h内,PCCs/msFGFR2c在pH=5.5和7.4的体外环境下释放率分别达到了84%和76%,HTCC/msFGFR2c则分别为76%和70%,表明PCCs纳米系统具有较好的药物缓释功能。体外细胞毒性实验结果表明:当PCCs纳米粒(PCCs-NP)的浓度达到2.0mg/mL时,对MRC-5和Calu-3细胞均无毒性,而HTCC纳米粒(HTCC-NP)的浓度达到0.5mg/mL时就已经对MRC-5和Calu-3细胞有毒性,说明PCCs-NP的生物相容性优于HTCC-NP。

细胞摄取实验结果表明:MRC-5和Calu-3细胞摄取PCCs和HTCC及其纳米载体粒子存在时间和浓度依赖性,在一定摄取时间和摄取浓度范围内呈正相关。荧光纳米载体微粒在亚细胞水平的分布实验得到:在2.0h内被摄入的纳米载体粒子主要分布在细胞Calu-3的细胞质中,在细胞溶酶体内没有观察到纳米载体粒子。以Calu-3细胞建立Transwell呼吸道上皮细胞转运模型。

TEER实验结果显示:在AP端加入浓度为0.125mg/mL的荧光标记PCCs-NP和HTCC-NP纳米载体粒子作用4h,经过24h后TEER值均能够完全恢复,表明两者在该浓度作用4h内对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的;但是在AP端加入浓度为0.25mg/mL的荧光标记纳米粒子时,PCCs-NP对Calu-3单细胞层TEER的影响是可恢复,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层TEER的影响不可恢复,表明此浓度作用下PCCs-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响则不可逆。转运试验结果表明:壳聚糖衍生物PCCs和HTCC制成纳米粒子PCCs-NP、HTCC-NP后,其跨Calu-3细胞单层的转运效率和表观渗透系数Papp都有所提高。

免疫荧光实验表明:在作用浓度为0.25mg/mL时,PCCs-NP对紧密连接蛋白ZO-1的表达几乎没有影响,PCCs和HTCC都能在不同程度上减弱ZO-1的表达,HTCC-NP则能够完全抑制ZO-1的表达,表明两种纳米载体具有不同的跨上皮细胞层机制。建立博来霉素诱导的Wistar大鼠肺纤维化模型,通过肺给药方式研究了负载msFGFR2c的纳米系统对肺纤维化大鼠的疗效。

大鼠的体重、肺组织HE及Massion染色、X光结果都表明PCCs/msFGFR2c纳米系统对肺纤维化有明显的抑制作用,且优于自由msFGFR2c组。总的来说,本研究制备的仿生纳米载体粒子具有良好的生物相容性,可以改善蛋白药物的经肺给药治疗效果,有望成为一种优良的肺给药蛋白药物载体材料。

参考文献

[1]Self assembling nanocomposites for protein delivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs[J].Stefano Salmaso,Paolo Caliceti.International Journal of Pharmaceutics.2013(1)

[2]Airway delivery of peptides and proteins using nanoparticles[J].Christophe Y.Dombu,Didier Betbeder.Biomaterials.2013(2)

[3]Chitosan-based drug nanocarriers:Where do we stand?[J].Marcos Garcia-Fuentes,Maria J.Alonso.Journal of Controlled Release.2012(2)

[4]Polyamidoamine dendrimers surface-engineered with biomimetic phosphorylcholine as potential drug delivery carriers[J].Lan Jia,Jian-Ping Xu,Hai Wang,Jian Ji.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces.2011(1)

[5]房邦仁.细胞膜仿生壳聚糖基纳米载体用于蛋白药物的肺给药治疗[D].暨南大学,2018.