LMH细胞复苏传代培养步骤,形态特征,常见问题

LMH鸡肝癌细胞背景简介

LMH鸡肝癌细胞系是于1981年由Tomoyuki Kitagawa在日本东京都渡岛区Kami Ikebukuro癌症研究所建立的一种原发性肝细胞癌上皮细胞系。该细胞系癌组织来源于通过二乙基亚硝胺的长期治疗的Leghorn鸡肝脏中诱发的肿瘤结节。LMH细胞表达葡萄糖-6-磷酸酶和微弱的微观ATP酶活性，含有低水平的功能性雌激素受体，可诱导肝脏特异性载脂蛋白II(apoII)基因的表达。LMH细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。

LMH鸡肝癌细胞产品信息

细胞名称：LMH，鸡肝癌细胞

种属来源：鸡

组织来源：肝

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

保藏机构：ATCC; CRL-2117;BCRC; 60320BCRJ; 0361;CCLV; CCLV-RIE 0417;CLS; 601411;JCRB; JCRB0237;NCBI_Iran; C592;

培养基：DMEM/F-12+10% FBS(特级胎牛血清)+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：39℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

LMH鸡肝癌细胞形态特征

LMH细胞的形态是上皮细胞(树状)，并且具有贴壁生长的特性，但其贴壁能力较差。这种细胞表达葡萄糖-6-磷酸酶和微弱的小管ATP酶活性，能够在无胸腺裸鼠中形成肿瘤。此外，LMH细胞含有低水平的功能性雌激素受体，并且可诱导肝特异性载脂蛋白II(apoII)基因的表达。这些特性使得LMH细胞系成为一种有用的工具，可用于转染研究。

LMH细胞复苏传代培养步骤

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：DMEM/F-12培养基、FBS特级胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

LMH细胞复苏操作

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLLMH细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的6cm培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀LMH细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定LMH细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

LMH细胞传代操作

1) )从培养箱拿出LMH细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

2)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

3)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

4)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有LMH细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

5)将装有LMH细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀LMH细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

6) 确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

LMH鸡肝癌细胞传代小贴士

LMH细胞贴壁性差，培养前需提前准备好用0.1%明胶包被的培养瓶或使用Corning的cellbind细胞培养瓶。操作时不要冲刷到细胞层，2-3天换液，90%以上汇合度传代。

LMH鸡肝癌细胞冻存准备

从培养箱拿出LMH细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

LMH鸡肝癌细胞细胞冻存步骤

a.收集LMH细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

LMH鸡肝癌细胞培养常见问题

1.LMH细胞不贴壁?

LMH细胞细胞贴壁性差，培养前需提前准备好用多聚赖氨酸包被的培养瓶或使用Corning的cellbind细胞培养瓶。

2.LMH鸡肝癌细胞如何包被?

多聚赖氨酸包被方法

0.0025mg/ml-0.1mg/ml多聚赖氨酸，37℃ 5分钟以上(培养箱15分钟左右就行)或常温过夜(6cm皿2ml 10cm皿4-5ml)。每株细胞对多聚赖氨酸耐受不一样，因多聚赖氨酸有细胞毒性，在不影响贴壁的情况下，尽量低浓度使用。包被好，用pbs清洗三次后使用。

明胶包被方法

明胶不用洗，培养液浸泡三十分钟，吸掉液体后，直接用

明胶多久需要换一次，每次铺都要包被，一次一换

3.多聚赖氨酸可以重复使用吗?

可以。但是一般不超过三次。

4.培养过程中发现LMH细胞回缩或增殖较慢?

可提高5%-10%血清比例，用39°培养箱培养。

5.LMH细胞消化时间为多久?

LMH细胞较易消化，培养箱消化2分钟左右。

6.LMH细胞复苏出现空泡 部分不贴壁 细胞干瘪？

分析原因

a. 营养不够或血清不适应，该细胞对血清要求较高，建议使用特级胎牛血清培养。

b. 多聚赖氨酸浓度过高或包被过久，多聚赖氨酸有细胞毒性。

c. 冻存细胞，复苏状态差

d. 消化过度

整改措施

a. 考虑复苏状态差，提高5%血清，未有改善，增殖很慢，细胞很瘦，不展开。

b. 用PBS稀释1倍多聚赖氨酸(0.1mg/ml)浓度，减少包被时间(培养箱5-10分钟)。重新复苏1株细胞后，细胞状态良好。

LMH鸡肝癌细胞应用

LMH鸡肝癌细胞系可以用于禽腺病毒4型弱毒株ON1的生物学特性及其免疫效力初步评价

为了研发用于HHS防控的FAdV-4弱毒活疫苗,本研究对分离自健康鸡的FAdV-4毒株ON1的生物学特性和体外增殖规律以及对FAdV-4中国流行株强毒攻击的保护效果进行了研究,以期为进一步研发用于防控HHS的弱毒活疫苗奠定基础。

研究内容包括以下2个方面

1. FAdV-4弱毒株ON1的生物学特性研究为了解FAdV-4毒株ON1的生物学特性,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR和病毒滴度测定方法,研究该毒株在LMH鸡肝癌细胞系中的生长特性和增殖规律。

结果显示FAdV-4毒株ON1在LMH中能够很好增殖,呈现典型的腺病毒感染细胞病变,不同时间点的病毒滴度与病毒基因组拷贝数呈正相关,病毒感染后72 h时滴度最高,且培养上清中亦含有大量成熟的病毒粒子;将FAdV-4毒株ON1经口感染7日龄SPF鸡,所有感染鸡临床没有任何症状;ON1感染鸡在感染后12小时可从泄殖腔分离出病毒,2周的观察期内可持续检测到排毒;采集感染鸡的组织器官制备病理切片进行HE染色,结果显示ON1感染鸡各组织器官与未感染对照鸡没有明显差异。证明毒株ON1临床上对鸡不具有致病性。

2. FAdV-4弱毒株ON1的免疫原性和免疫效力为评价FAdV-4毒株ON1的免疫原性,本试验利用LMH鸡肝癌细胞系培养FAdV-4毒株ON1,将60只7日龄SPF鸡随机分为两组,经口服感染FAdV-4 ON1毒株,免疫后在不同时间点检测ON1毒株免疫鸡的FAdV-4特异性抗体水平,分析其免疫原性,同时采集泄殖腔拭子检测免疫鸡的排毒情况。

结果显示,ON1免疫鸡均产生FAdV-4特异性抗体和中和抗体,抗体水平在免疫后2周达到高峰期,并维持较长时间。ON1免疫鸡在感染后2周的观察期内持续排毒,病毒的排毒持续期与诱导的抗体水平相一致。在免疫后2周使用FAdV-4中国流行强毒株攻毒,以评价弱毒疫苗的免疫效力。

结果显示,ON1免疫后2周用FAdV-4中国流行株强毒株攻毒,ON1免疫可以对FAdV-4中国流行强毒株提供75%保护,而对照组鸡全部死亡。结果表明FAdV-4 ON1毒株免疫可以对FAdV-4中国流行强毒株的攻击提供部分保护作用。

参考文献

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