MKN7细胞难消化,MKN7细胞培养常见问题及应用

MKN-7人胃癌细胞来源

MKN-7细胞是在1989由Hojo, H从一位39岁男性患者的高分化的胃管状腺癌中建立的。MKN-7细胞高表达c-erb B2的产物。

MKN-7人胃癌细胞形态特征

MKN-7人胃癌细胞产品信息

细胞名称：MKN-7，人胃癌细胞

细胞别称：MKN-7; MKN 7;MKN7; 人胃癌细胞

种属来源：人

年龄性别：女，39岁

组织来源：胃

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,13;D3S1358：17;D5S818：9,13;D7S820：9,11;D8S1179：15;D13S317：8,12;D16S539：9,10;D18S51：13,18;D21S11：29,32.2;FGA：23;Penta D：10,11;Penta E：18;TH01：7,9;TPOX：9;vWA：17;

保藏机构：CLS; 305104;JCRB; JCRB1025;RCB; RCB0999;RCB; RCB3687;TKG; TKG 0228;

培养基：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S

培养条件：气相：100%空气;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

MKN-7人胃癌细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：RPMI-1640培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

MKN-7人胃癌细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLMKN-7细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀MKN-7细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定MKN-7细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

MKN-7人胃癌细胞传代操作

1)从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

2)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

3)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个MKN-7细胞，消化 1-3min(根据MKN-7细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

4)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有MKN-7细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

5)将装有细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

6) 确定MKN-7细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

MKN-7人胃癌细胞冻存准备

从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

MKN-7细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据MKN-7细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

MKN-7细胞培养注意事项

a.生长速度很慢

MKN-7人胃癌细胞倍增时间约3天左右，正常培养5~7天可传代一次;

b.贴壁形态展开较大

MKN-7人胃癌细胞消化之后一瓶细胞量比较少，传代时的比例建议1：2，冻存时1瓶细胞只能冻一管;

c.折光度较低

MKN-7人胃癌细胞在显微镜下观察时，轮廓有时不清晰，观察时显微镜亮度请勿太高，否则可能看不到细胞边界;

d.较难消化

常规的消化方法难以把控，加入培养基后细胞会迅速贴壁。建议使用浸泡消化，使用胰酶完全浸润MKN-7人胃癌细胞，直接放入37℃ 的环境中进行消化，消化时间一般在7~10分钟。

待部分细胞脱壁漂起后，镜下观察，大部分细胞有脱壁迹象后加入适量胰酶，轻轻吹打，将细胞吹落、吹散，随后吸出器皿，加入培养基终止消化，离心收集。

若还有少量细胞无法轻轻吹下，则在吸出脱落细胞后，加入胰酶继续消化再收集。

小贴士：使用这种消化方法，可能会造成一定的细胞损失。

MKN-7人胃癌细胞培养常见问题

1.MKN-7人胃癌细胞传代密度

MKN-7细胞呈上皮样生长，是密度依赖型细胞，接种细胞数量直接影响细胞生长速度。建议融合度90%以上再进行传代。

2.MKN-7人胃癌细胞消化时间多久

MKN-7细胞不易消化，消化时间建议培养箱5分钟以上，显微镜下观察细胞全部脱落，再终止消化。终止后，建议使用完培收集2-3次，尽量减少操作损失。

3.MKN-7细胞冻存密度多大

冻存MKN-7人胃癌细胞时，建议密度要略大于普通细胞(两盘10cm皿冻3管)，以保证复苏后细胞量。

MKN-7人胃癌细胞应用

MKN7人胃癌贴壁细胞系可以用于PNO1通过自噬效应促进胃癌增殖的机制研究

自噬作为一种程序性死亡机制在肿瘤中的作用越来越受到研究者们的关注,靶向自噬已经成为肿瘤治疗的一种重要手段。之前的研究表明核糖体装配因子PNO1可以调节肿瘤的增殖、侵袭、自噬和凋亡等表型,但目前在胃癌中的作用还没有被报道。本研究旨在揭示PNO1在胃癌中的作用及调节机制,为胃癌治疗提供新的靶标。

方法：利用生物数据库中的信息检测PNO1在胃癌和癌旁组织中的表达,并收集青岛大学附属医院经病理确诊的胃癌和癌旁手术标本进行免疫组化分析验证,使用小干扰RNA、慢病毒颗粒构建PNO1敲低和过表达的胃癌细胞株,使用蛋白免疫印迹和实时定量PCR来验证PNO1在胃癌细胞的表达及转染效率,通过平板克隆形成实验和Ed U细胞增殖实验检测PNO1对胃癌细胞增殖的影响,使用蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检测PNO1对自噬的调节,通过蛋白免疫印迹分析PNO1对PI3K/AKT/mtor信号通路的调控作用,最后通过小鼠胃原位荷瘤模型验证PNO1在体内对胃癌增殖的作用。

结果：在本研究中,发现PNO1在胃癌组织和细胞中高表达并且相对高表达的PNO1水平与胃癌患者的不良预后相关,过表达PNO1提高了胃癌细胞的增殖水平,敲低PNO1抑制了体内外胃癌的增殖能力,并提高了胃癌细胞的自噬水平,抑制自噬逆转了PNO1敲低导致胃癌细胞增殖能力下降的趋势,此外,敲低PNO1还抑制了PI3K/AKT/mtor信号通路的激活。

结论：研究表明PNO1高表达是胃癌患者的不良预后因素,PNO1通过抑制自噬效应促进了胃癌的增殖能力,这为探索胃癌发病机制提供了新的思路,靶向PNO1/自噬轴成为胃癌治疗的潜在方案。

参考文献

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