786O细胞系培养技巧,应用及是否在小鼠中成瘤分析

786-O人肾透明细胞腺癌细胞背景介绍

786-O细胞源自一个原发性透明细胞癌。此细胞有微绒毛和桥粒，能在软琼脂是生长。 此细胞生成的一个PTH样的多肽与乳癌和肺癌中的肽相似。这个多肽的N端与PTH相似，活性与PTH相似，分子量为6000道尔。786-O细胞可以用于3D细胞培养，也是一种合适的转染宿主。

786O细胞形态特征

786-O人肾透明细胞腺癌细胞产品信息

细胞名称：786-O，人肾透明细胞腺癌细胞

细胞别称：786-o; 786O; 786-0; 786.O; 786-O RCC; RCC 786-O; RCC_7860; RCC 7860; 7860; 786-0WT;人肾透明细胞腺癌细胞

种属来源：人

年龄性别：男;58岁

组织来源：肾;肾细胞腺癌

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

STR位点信息：Amelogenin：X，Y;CSF1PO：10;D13S317：8;D16S539：12;D18S51：13，14;D19S433：14，15;D21S11：29，30;D2S1338：17，18;D3S1358：16;D5S818：9;D7S820：11;D8S1179：13;FGA：24;TH01：6，9.3;TPOX：8，11;vWA：15，17;

保藏机构：ATCC; CRL-1932 BCRC; 60243;中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心

培养基：1640+10%FBS+PS

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

倍增时间：~24-45 hours

致瘤性：Yes, in immunosuppressed hamsters.

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

786-O人肾透明细胞腺癌细胞细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：1640基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

786-O人肾透明细胞腺癌细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mL细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

786-O人肾透明细胞腺癌细胞传代操作

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好786-O细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察786-O细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

4)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

5)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

6)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

7)将装有786-O细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

8) 确定786-O细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

786-O人肾透明细胞腺癌细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

786-O人肾透明细胞腺癌细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

786-O人肾透明细胞腺癌细胞培养技巧

显微镜下见786-O细胞,呈多角形或长梭形，贴壁生长,每3天传代1次。以1:4比例传代,细胞生长非常快,适时进行换液,细胞密度过大时有部分细胞漂浮。

786-O细胞株对生长环境要求不是很高，培养难度不大，37℃、5%CO2、95%饱和湿度的孵箱中常规培养,RP-MI1640 培养基加10%胎牛血清或新生牛血清均可。消化细胞时,应在显微镜下观察,大部分细胞变圆时停止消化,以免消化过度对细胞造成损伤。细胞传代可按1:4至1:12比例进行,传代细胞数量多则生长较快,根据具体情况传代比例可在此范围内进行调整。需要注意的是,培养任何细胞操作过程都必须做到无菌原则。所以,一般都在培养基里加青霉素、链霉素(均为100U/mL),可在一定程度避免细菌污染;另外,还要注意防止空气中的霉菌污染。一般来讲,细胞受到污染,培养基会过早变得偏碱性,颜色由原来的红色变为金黄色,显微镜下可见大量的细菌,并且有活跃的运动;简便的处理办法是彻底销毁受污染的细胞,查清任何可能受污染的环节，并做相应的处理。除此以外,也应注意防止受到实验室里的Hela细胞污染。鉴别方法有两点:首先786-O细胞的染色体特征同Hela细胞的不同，尤其是Y染色体;其次是酶学上的不同，786-O细胞所含的葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)为B型，而后者为A型。786-O细胞在体外被稳定地传代培养,是一株良好的实验细胞模型。首先因为种属是人,实验研究可最大限度地接近人体实验。另外,由于培养特性稳定,使得科研人员精确地复制实验条件成为可能。

786-O细胞在小鼠中是否成瘤

786-O是来源于人的肾癌细胞系，经皮下成瘤检测实验表明该细胞系在皮下接种后，能正常成瘤。

786-O细胞成瘤性验证

为验证 786-O 细胞系能否实现皮下成瘤，我们设计了在 M-NSG 小鼠右侧腋下接种一定量的 786-O 细胞，其成瘤结果说明：在皮下接种 786-O 细胞系能正常成瘤。如图二所示：

图二、 786-O 细胞系在M-NSG小鼠中的成瘤曲线(n=5)

小鼠体重变化曲线

在验证 786-O 细胞系成瘤性的同时，为了从体重方面检测该细胞系对小鼠是否有负面影响，我们也持续监测了小鼠的体重情况，从结果来看，小鼠在整个成瘤过程中，整体体重呈先增长后下降趋势，但小鼠精神状态无明显异常，期体重变化趋势如图三所示：

图三、 786-O 细胞系在成瘤验证过程中小鼠体重变化趋势(n=5)

786-O人肾透明细胞腺癌细胞的应用

786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞主要用于科研实验研究，如有实验探讨PI3K-Akt信号通路PI3K抑制剂LY294002对786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞增殖和凋亡的影响。采用MTT法检测LY294002对786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞增殖能力的影响，倒置显微镜观察不同浓度及时间点处理LY294002对786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞形态的影响，Hochest染色检测其对786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞凋亡的影响。MTT结果显示LY294002对细胞增殖表现出显著抑制(P0.05或P0.01，vs阴性)，并表现为药物剂量和时间的依赖性，形态学显示，相对于正常细胞，LY294002可以使细胞生长受到不同程度的抑制，表现为体积缩小，突起变少等现象，Hochest染色结果显示，随着LY294002浓度的加大，细胞逐渐出现染色质凝聚，出现凋亡小体进而完成凋亡。结论PI3K抑制剂LY294002可明显抑制786-O/786-0/人肾透明细胞腺癌细胞增殖，促进786-0细胞凋亡，并且呈现浓度依赖性变化。

人肾透明细胞腺癌细胞可以用于LY294002抑制PI3K/AKT信号通路对人肾透明细胞腺癌细胞增殖和凋亡的影响

应用PI3K高特异抑制剂2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢-1-苯并吡喃-4-酮(LY294002)作用于人肾透明细胞癌786-0细胞系，探讨LY294002对人肾透明细胞癌细胞凋亡的影响及机制，从而为其临床治疗的研究奠定基础。

方法：

(1)人肾透明细胞癌786-0细胞系培养，建立细胞模型。

(2)将对数生长期的肾透明细胞癌细胞分组培养。用不同药物浓度的LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)处理肾透明细胞癌细胞,MTT法检测癌细胞在不同的作用时间(24h、48h、72h)下的OD值，计算增殖抑制率,绘制肾癌细胞浓度-抑制率曲线及时间-抑制率曲线。用Hoechst染色法观察肾透明细胞癌细胞，经LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)不同的作用时间(24h、48h、72h)下,细胞凋亡情况。

(3)采用RT-PCR法分别检测LY294002在不同浓度及时间点对786-O细胞处理后细胞的PI3K、mTOR、Akt mRNA的表达情况，探讨其对PI3K、mTOR、Akt mRNA表达的影响，及其对786-O细胞增殖的影响。

结果

(1)通过MTT法检测LY294002在24、48、72h均表现出增殖抑制作用，当LY294002浓度从1μg/mL增加到40μg/mL时，作用24h细胞抑制率从6%增加到55%，作用48h时，细胞抑制率从12%增加到78%，作用72h时细胞抑制率从14%增加到84%，同一时间不同浓度的各组细胞与阴性对照组相比，抑制率有统计学意义(P<0.05或0.01)，提示随着LY294002浓度的增加，其抑制786-O细胞增殖的作用逐渐增加。用倒置显微镜下观察LY294002用药对786-O细胞生长及形态的影响，各浓度LY294002作用48h时细胞形态变化最为典型。结果显示，相对于正常细胞，LY294002可以令细胞生长受到不同程度的抑制，表现出浓度依赖性变化。正常细胞的形态整齐，边缘清晰，细胞排列紧密，而随药物浓度的增加，药物作用下细胞变圆漂浮无法正常贴壁，细胞固缩，细胞密度减少。

(2)通过Hoechst染色法在荧光显微镜下观察对照组细胞核呈弥散均匀淡蓝色的荧光;出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状亮蓝色荧光;相对于未经药物处理的786-0细胞，1μg/mL的药物处理48h后，细胞形态还未出现明显的变化;2.5μg/mL药物处理可见个别细胞内出现染色质凝聚，出现凋亡小体;5μg/mL药物处理染色质荧光增强，出现凋亡小体的细胞增多;10μg/mL药物处理可见凋亡前期的细胞进一步增多;20μg/mL药物处理可见凋亡小体突破细胞膜开始释放;40μg/mL药物处理可见大部分细胞凋亡小体释放，完成凋亡。

(3)在LY294002处理细胞48h，采用1、2.5、5、10、20、30、40μg/mL浓度处理下，PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达显著受到抑制，并且呈现出随药物浓度的变化出现抑制程度增大的正比关系;细胞增殖实验显示随着药物浓度及其作用时间的延长，其抑制肿瘤作用逐渐增加。

786o细胞系moi范围

786o 细胞系是一种来源于人类的肿瘤细胞系，常用于肿瘤研究和药物筛选。在实验室中，研究人员需要通过调整细胞密度来控制细胞系的生长，这就涉及到一个重要的参数:moi。

moi，即细胞密度的倒数，是衡量细胞生长状态的重要指标。在细胞培养过程中，moi的范围会直接影响到细胞的生长状态和实验结果。对于786o细胞系，其moi范围通常在0.1-10 之间。当 moi过低时，细胞密度过大，细胞之间的竞争激烈，容易导致细胞死亡。而当moi过高时，细胞密度过低，细胞生长缓慢，会影响实验的进度和结果。因此，选择合适的moi范围对于 7860细胞系的生长至关重要。研究发现，对于7860细胞系，最适合的moi 范围在1-5之间。在这个范围内，细胞生长迅速，且细胞状态稳定，适合进行各种实验。总的来说，moi是控制细胞系生长的重要参数，对于7860细胞系，其最适合的moi范围在1-5之间。

参考文献

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Thiede MA, et al. Human renal carcinoma expresses two messages encoding a parathyroid hormone-like peptide: evidence for the alternative splicing of a single- copy gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4605-4609, 1988. PubMed: 3290897

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