猪子宫内膜上皮永生化细胞复苏,传代,冻存步骤

猪子宫内膜上皮永生化细胞背景介绍

猪子宫内膜上皮细胞永生化通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。

子宫内膜是指构成哺乳类子宫内壁的一层。子宫内膜对动情素和孕激素都起反应，因此可随着性周期(发情周期、月经周期)发生显著的变化。子宫内膜覆盖着粘膜，由粘膜上皮与其下方的固有层所组成。粘膜上皮为柱状上皮、立方上皮或复层柱状上皮，动情素分泌时，各上皮细胞将长大、分裂使数目增多。

猪子宫内膜上皮永生化细胞形态特征

猪子宫内膜上皮细胞永生化产品信息

细胞名称：猪子宫内膜上皮细胞永生化

种属来源：猪

组织来源：实验动物的正常子宫组织

生长特性：贴壁生长

细胞形态：铺路石状细胞，不规则细胞

细胞鉴定：广谱角蛋白(PCK)或细胞角蛋白-19(CK-19)免疫荧光染色为阳性。经鉴定细胞纯度高于90%，不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌

培养基：猪子宫内膜上皮细胞永生化专用培养基

培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

猪子宫内膜上皮永生化细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：猪子宫内膜上皮细胞永生化专用培养基、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

猪子宫内膜上皮永生化细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mL猪子宫内膜上皮永生化细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀猪子宫内膜上皮永生化细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查细胞密度。

猪子宫内膜上皮永生化细胞传代操作

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出猪子宫内膜上皮永生化细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

4)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

5)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

6)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对猪子宫内膜上皮永生化细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

7)将装有猪子宫内膜上皮永生化细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

8) 确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

猪子宫内膜上皮永生化细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出猪子宫内膜上皮永生化细胞，在显微镜下观察猪子宫内膜上皮永生化细胞细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

猪子宫内膜上皮永生化细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

猪子宫内膜上皮细胞的分离培养

子宫内膜主要由上皮细胞和间质细胞组成，不仅是一个保护性内膜，而且是具有多种分泌功能的内膜。胚胎着床阶段是母猪怀孕后胎儿死亡的高峰期之一，而胚胎着床是与子宫内膜上皮细胞紧密相连的，所以对子宫内膜上皮细胞进行体外培养，探讨子宫内膜上皮细胞分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程，为进一步研究子宫内膜上皮细胞在胚胎附置时的作用，提供理论依据和实验模型。

材料与方法

屠宰场采集卵泡期子宫，于切口处结扎，迅速放入冰盒带回实验室。用75%酒精擦拭子宫外表面，PBS冲洗2-3遍。在超净台内，沿子宫角纵向剪开，用PBS冲洗2次。用剪刀把子宫内膜上皮组织剪成条状，置PBS中冲洗，直至液体清亮，剪成1mm3的肉泥状，接种于培养瓶，用0.1%胶原蛋白酶I，37℃水浴摇床消化2.5h，加入等量的终止液(含10%FBS胎牛血清的DMEM)终止消化。把消化液和终止液的混合液过100目细胞筛，滤液吸至离心管，500r/min离心5min，弃上清，沉淀用10mLPBS吹打悬浮。500r/min离心5min，弃上清。完全培养液将细胞沉淀吹打悬浮，细胞计数后，以2x10⁵个细胞/ml接种于细胞培养瓶，置37℃、5%CO2培养箱中培养。第1次换液于2d后，以后隔2-3d更换培养液1次。培养到细胞几乎聚合成片，大约需要5-7d时间。传代培养时，倒掉培养液，2mLPBS漂洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化3-5min，待大部分细胞变圆透亮悬浮时，立即加入等体积的终止液终止消化，吹打数次，将细胞悬浮液转入至离心管，1000r/min离心5min，弃上清，用5mLPBS吹打悬浮，1000r/min离心5min，弃上清，将细胞沉淀悬浮接种于新细胞培养瓶中培养。

结果

猪子宫内膜上皮细胞，在培养24h后基本已贴壁，并成漩涡状排列的致密单层细胞集落，偶见散在的间质细胞插入性生长。培养2d后，上皮细胞80%融合，呈梭形，边界清楚，排列紧密，胞质呈颗粒状，胞核大而圆，核仁明显，细胞集落扩大并相互融合成片，培养液颜色变淡、变浑浊。培养第3d上皮细胞基本铺满25cm3的培养瓶，细胞呈梭形，生长旺盛，可以体外进行传代培养，一般可连续培养6代左右，之后细胞形态会发生改变，细胞变大，由梭形向成纤维状转变，集落漩涡状向散在单个生长，贴壁及生长速度变缓。

讨论

在猪子宫内膜上皮组织获取后，用胶原蛋白酶消化，把消化液和终止液的混合液过100目细胞筛过滤，滤液吸至离心管，500r/min离心5min，此时上清中主要为间质细胞，沉淀主要为上皮细胞。在子宫内膜上皮细胞纯化时，主要利用间质细胞和上皮细胞贴壁的时间不一样，巧妙的把两种细胞分开。本研究建立的猪子宫内膜细胞培养方法，可在短时间内获得足够数量的子宫内膜上皮细胞，并可以体外培养，为研究子宫内膜上皮细胞在胚胎附置时的作用，提供了一个理想的实验模型。