caco2细胞培养注意事项及caco2细胞有空泡怎么办

Caco-2人结直肠腺癌细胞简介

Caco-2 人结直肠腺癌细胞分离自一位72岁男性直肠原位癌，人结肠癌Caco-2细胞系在标准培养条件下汇合后，自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型。Caco-2细胞分离自直肠原位癌;当长到满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白Ⅱ，并呈角质蛋白阳性。

Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可以用来进行模拟体内肠转运的实验。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似。

Caco-2人结直肠腺癌细胞产品信息

细胞名称：Caco-2，人结直肠腺癌细胞

细胞别称：CaCo-2; CACO-2; Caco 2; CACO 2; CACO2; CaCo2; CaCO2; Caco2; Caco-2/ATCC

种属来源：人

性别年龄：男 72岁

组织来源：结肠

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样

染色体：85~90，91~100

倍增时间：~60-80 hours

致瘤性：Yes, in nude mice; forms moderately well differentiated adenocarcinoma consistent with colonic primary (grade II).

基因表达情况：keratin, retinoic acid binding protein 1, retinol binding protein 2

STR位点信息：Amelogenin：X；CSF1PO：11；D13S317：11，13，14；D16S539：12，13；D18S51：12；D19S433：15；D21S11：30，32；D2S1338：17，19.2，25；D3S1358：14，17；D5S818：12，13；D7S820：11，12；D8S1179：12，14；FGA：19；TH01：6；TPOX：9，11；vWA：16，18；

保藏机构：ATCC; HTB-37 BCRJ; 0059 DSMZ; ACC-169 ECACC; 09042001 ECACC; 86010202

受体表达情况：This cell line expressed heat stable enterotoxin (Sta, E. coli) and epidermal growth factor (EGF).

Caco2细胞形态 

Caco-2细胞培养操作说明

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul;黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷75%酒精

Caco-2人结直肠腺癌细胞培养操作步骤

Caco-2人结直肠腺癌细胞复苏步骤

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟（或者放在超净工作台常温放 30min）。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头（已灭菌），培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2.待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mLCaco-2人结直肠腺癌细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3.用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，（若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中），标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4.用废液泵（吸力不要太大）取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后（充分混匀），将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀Caco-2人结直肠腺癌细胞（一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀），最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5.确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。（尽量平直放入不要晃动），第二天换液并检查细胞密度。

Caco-2人结直肠腺癌细胞传代操作

1. 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS（试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上）；传代用培养皿，巴士管，离心管（已灭菌），枪头（已灭菌），移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵；

2.从培养箱拿出Caco-2人结直肠腺癌细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代；

3.打开废液泵，用废液泵吸头（吸力不要太大）取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS（6cm 皿）到细胞培养皿中（若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS），轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次；

4.用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02% EDTA）于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min（根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟）后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

5.用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对Caco-2人结直肠腺癌细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

6.将装有Caco-2人结直肠腺癌细胞悬液的离心管放入离心机中（配平），1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后（充分混匀），将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞（一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀），最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

7.确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。（尽量平直放入不要晃动）。第二天再观察细胞密度。

Caco-2人结直肠腺癌细胞冻存准备

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS（试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上）；传代用培养皿，巴士管，离心管（已灭菌），枪头（已灭菌），移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵；

2)从培养箱拿出Caco-2人结直肠腺癌细胞，在显微镜下观察Hela细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

Caco-2人结直肠腺癌细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签（细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基）。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

Caco-2人结直肠腺癌细胞培养常见问题

1.Caco-2人结直肠腺癌细胞有空泡是正常的吗?

Caco-2细胞群中常常含有巨大的空泡，这是细胞本身的特性，属于正常现象。

Caco-2有少量发亮的细胞漂浮或黏附在细胞克隆上，是正常的，随后会进入克隆并正常生长。所以避免频繁观察细胞，可以减少漂浮细胞产生。如果细胞随着培养过程，漂浮得越来越严重，甚至大块儿飘起，就要检查培养基成分、培养环境是否出现异常。细胞密度越高，消化时间越长。

血清质量差异可能引起细胞状态变化，建议选用高质量的胎牛血清。

2.Caco-2人结直肠腺癌细胞消化时间多久?

Caco-2细胞与细胞间连接紧密，细胞难以消化解离。生长时间越长，细胞间连接越紧密，消化时间越长。消化时间为5-10分钟，该细胞难以被吹散为单个细胞，当细胞能够被吹散为小的细胞团块，即可终止消化。

如果消化5-10分钟，细胞部分脱落，另一部分仍然贴壁紧密，可以将脱落细胞转移至离心管，向原瓶中加入新的胰酶，放入培养箱继续消化剩余细胞，每隔1min拿出来观察，直到细胞滑落。

3.Caco-2人结直肠腺癌细胞传代多久长满?

Caco-2传代周期较长，倍增时间约为72h。Caco-2贴壁和生长都较为缓慢。80%密度1:2传代的前提下，Caco-2通常需要培养5-7天再传代。

4.Caco-2人结直肠腺癌细胞复苏不贴壁?

Caco-2人结直肠腺癌细胞贴壁较慢，在复苏或传代初期，若有许多细胞或细胞碎片漂浮为正常现象，为避免在细胞附着初期干扰细胞，建议到第三天才换液。待细胞贴壁后，一周即可长满(1:3传代)，若细胞生长过慢，可适当调整血清浓度到20%。

Caco-2培养基里添加的胎牛血清比例为10%，当血清比例降低，贴壁性下降时，补充胎牛血清至20%，继续培养1-2天，细胞即可贴壁。检查培养基是否偏碱(呈紫红色)，偏碱的培养基可能导致细胞无法贴壁。

5.Caco-2人结直肠腺癌细胞漂浮细胞多怎么办?

有少量发亮的细胞漂浮或黏附在细胞克隆上，是正常的，随后会进入克隆并正常生长。所以避免频繁观察细胞，可以减少漂浮细胞产生。如果Caco-2细胞随着培养过程，漂浮得越来越严重，甚至大块儿飘起，就要检查培养基成分、培养环境是否出现异常了。

Caco-2人结直肠腺癌细胞培养注意事项

a.Caco-2细胞贴壁慢特别是刚复苏时，一般2-3天贴壁展开，会有空泡。

b.Caco-2细胞在传代细胞中，注意消化散，否则难以贴壁。

c.成团生长，细胞密度越大，表面空泡黑点越多。

d.一般Caco-2细胞长至80%传代，细胞成片，其实密度很大。

e.Caco-2细胞生长太满对细胞状态影响严重，传代后易碎，死亡。

f.Caco-2细胞生长时间越长，消化时间越长。

Caco-2细胞文献溯源

1979年始，迄今为止，关于人结直肠腺癌细胞的文献已有7030篇。

在pubmed数据库中用“Caco-2 cell line”搜索该关键词，第一篇为1979年M Rousset在Cancer Res.发表的“Presence and cell growth-related variations of glycogen in human colorectal adenocarcinoma cell lines in culture”。

文献概述

研究了四株人类结直肠腺癌细胞系(HT-29、HRT-18、SW-480和Caco-2)的异步和同步培养中，细胞内糖原水平的存在和动力学。

结果表明，在所研究的细胞系的细胞生长过程中，存在一种特定的糖原积累模式。

在异步培养中，糖原积累的动力学在不同的细胞系之间是相似的，其特点是在指数生长期糖原含量较低，而在平稳期则增加了3至4倍。而每个细胞系在这两个生长期中的糖原量是特定的。

在Caco-2、HRT-18、HT-29和SW-480细胞中找到的最大糖原值分别为258.5 +/- 6.9(S.D.)、88.9 +/- 2.6、87.5 +/- 3和17.5 +/- 1.8微克糖原/毫克蛋白质。

还研究了HT-29和HRT-18细胞系的同步培养中糖原积累的细胞周期动力学。这两个细胞系在S、G2和M期间表现出糖原含量较低的共同模式，并在G1期开始后增加(达到初始值的2.5到3倍)，在此阶段的中期达到峰值。随后在G1的后半部分有对称性的减少。

总结：该研究通过异步和同步培养的方法，揭示了人类结直肠腺癌细胞在细胞生长过程中糖原的动态变化。异步培养中不同细胞系的糖原积累模式相似，而同步培养中的两个细胞系表现出一致的糖原含量变化模式。

Caco-2细胞应用领域

Caco2细胞广泛用于研究药物在肠道的吸收和转运过程。由于Caco2细胞具有肠上皮细胞的特点，因此可以模拟药物穿过肠道黏膜的生理过程。科研人员可以在Caco2细胞培养基中添加不同浓度的药物，观察其在细胞内的转运和吸收情况，从而评估药物在体内的药代动力学。

此外，Caco2细胞还可以用于研究肠道疾病的发病机制，如炎症性肠病和肠道感染等。通过模拟疾病条件，科研人员可以观察Caco2细胞的相应反应，探究疾病的发展过程。

Caco-2细胞系最初来源于结肠癌。然而，其最有益的特性之一是其能够自发分化为具有许多与小肠吸收细胞相似的单层细胞，具有刷状边缘层。Caco-2细胞系异质性，包含具有稍许不同性质的细胞。

在代谢特征研究方面，学者利用Caco-2细胞研究其代谢产生的化合物，使用HPLC等技术进行含量测定;学者还可以利用Caco-2细胞探究该细胞的体外消化与代谢组学特征，如该细胞对利奈唑胺等药物的代谢特征，括了化合物的渗透性、转运过程、代谢酶的活性等方面。推断出药物在体内的代谢过程，并指导临床用药的调整和优化。

学者利用Caco-2细胞研究结肠癌细胞特征，包括细胞周期调控和细胞调亡。以及药物如去甲乌药碱和姜黄素对结肠癌细胞的吸收和转运。同时，Caco-2细胞还可以用来研究化合物如槲皮素、姜黄素的跨膜转运机制，使用分子对接等技术预测其转运特性。

研究人员利用Caco-2细胞研究其如何应对氧化应激以及细胞凋亡，包括产生抗氧化酶和应对脂多糖(LPS)等诱导的氧化压力，并使用高效液相色谱法(HPLC)等手段来检测细胞调亡相关的生化标记。

Caco-2细胞研究进展

近年来，随着细胞培养技术和细胞生物学研究的发展，Caco2细胞在药物研发、肠道疾病研究等领域发挥了重要作用。研究人员通过基因编辑技术和高通量筛选技术，不断提高Caco2细胞的模拟能力和研究效率。一些研究还表明，Caco2细胞可以应用于药物肠道黏膜递送系统、肠-肝循环等方面。

Caco-2细胞结论

Caco2细胞作为一种常用的结肠腺癌细胞系，具有模拟肠道黏膜和疾病发生机制的能力。在药物研发和肠道疾病研究中，Caco2细胞的应用将继续发挥重要作用。未来，随着细胞生物学和疾病模型的不断改进，Caco2细胞的研究前景仍然广阔。

Caco-2细胞标志物

1. 紧密连接蛋白：Claudins、Occludin

2. 跨膜糖蛋白：EpCAM

3. 黏附分子：Integrins

4. 钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白：SGLT1