293t细胞培养方法,形态,特点及应用

293T细胞背景介绍

293T细胞由HEK293细胞衍生而来，是SV40 largeT抗原稳转得到的细胞株，并含有SV40复制起始点与启动子区。许多含有SV40病毒复制起始位点的真核表达载体如pcDNA3.1，可以在293T细胞中复制，因此293T细胞广泛应用于病毒包装。293T细胞也适用于研究外源基因的表达，首先它易被转染，用磷酸钙转染效率可高达50%；其次它的蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可以比较容易地检测到表达的蛋白。另外瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式之一。

293T产品信息

细胞名称：293T，人胚肾细胞

细胞别称：Hek293T; HEK-293T; HEK 293T; HEK-293-T; HEK 293 T; 293-T; 293 T; 293T; Human Embryonic Kidney 293T; 293tsA1609neo

种属来源：人，女性

组织来源：肾

形态特征：上皮细胞样，贴壁生长

培养基：90% DMEM+10% FBS+PS

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳;温度：37℃

保藏机构：ATCC; CRL-3216 DSMZ; ACC-635;中国典型培养物保藏中心细胞库

传代方法：1:2至1:3，每周 2-3次

倍增时间：~24-30 hours

冻存条件：无血清冻存液，液氮储存

生物安全等级：1

293t细胞形态

293T人胚肾细胞培养方法

细胞培养的基本条件

实验室条件

1. 无菌环境：无菌室包括更衣室，缓冲间，风淋间，操作间

2. 仪器设备：超净工作台-操作平台、CO2 培养箱-细胞生长的环境、倒置显微镜-观察细胞、离心机-离心收集细胞、冰箱-放置培养基等试剂、水浴锅-复苏细胞、真空泵-收集废液、灭菌锅-灭菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-冻存细胞、纯水仪-制备一级水

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色 0-10ul；黄色 20-200ul;蓝色 100-1000ul)、滤器，吸管，多孔培养皿、6cm 皿、10cm 皿，培养瓶等。

4. 试剂：DMEM基础培养基、FBS胎牛血清、双抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范畴

1. 无菌操作：洗手，戴手套，穿实验服，常喷 75%酒精

293t细胞复苏方法

1.准备：紫外线照台 30min，提前打开水浴锅设置 37℃，培养基临用前放水浴箱里温育20 分钟(或者放在超净工作台常温放 30min)。在操作台上摆放好物品，左边放完全培养液，1mL 枪头(已灭菌)，培养皿，右上角放废液缸，1mL 移液枪，3mL 巴氏管。检查离心机，废液泵。

2)待水浴锅温度达到 37℃时，戴上手套和护目镜，从-196℃液氮罐中取出冻存管，将含有1 mL293T人胚肾细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，尽量保证冻存管内细胞 1min 内融化，加4 mL培养基混合均匀， 移入离心机中 100rpm 离心 3min，以 75%酒精喷冻存管外部，移入无菌操作台内。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鲜培养基到一个新的 6cm 培养皿中，(若离心后细胞量较多，可取 12mL 新鲜培养基到一个新的 10cm 培养皿中)，标记日期、所用培养基名称和细胞名称。

4)用废液泵(吸力不要太大)取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液加入到培养皿中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀293T人胚肾细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

5)确定细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱过夜。(尽量平直放入不要晃动)，第二天换液并检查293t细胞密度。

293T人胚肾细胞传代操作步骤

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上);传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿293T人胚肾细胞，在显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞状态良好，且密度达到 85%左右的时候即可进行传代;

4)打开废液泵，用废液泵吸头(吸力不要太大)取一个蓝色枪头吸走上清废液，用巴士管取 4ml 不含钙、镁离子的1xPBS(6cm 皿)到细胞培养皿中(若是 10cm 皿则取 8ml 1xPBS)，轻轻晃动以清洗细胞表面1-2次;

5)用废液泵吸走 PBS 废液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，拿起培养皿轻轻转动以便胰酶浸泡到每个细胞，消化 1-3min(根据细胞贴壁情况判断，贴壁较牢的消化时间长一点或者放入 CO2 培养箱中消化几分钟)后，在显微镜下观察细胞是否变圆变亮，一旦发现大量细胞胞质回缩，293T人胚肾细胞间隙增大，即将脱离培养皿底，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

6)用 1ml 移液枪轻柔吹打，保证培养皿底的每个角落都吹打到，边缘处也不能忽略(吹打时尽量避免产生气泡，因其对293T细胞有伤害;需轻柔吹打，用力吹打对细胞也有伤害)，把培养瓶中所有细胞悬液用吸 1ml 移液枪移入无菌离心管中。

7)将装有293T人胚肾细胞悬液的离心管放入离心机中(配平)，1000 转离心 3-5min，用废液泵取一个黄色枪头从冻存管中吸走上清，取 1-2mL 新鲜培养基重悬细胞后(充分混匀)，将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，将培养皿在超净工作台上以画“8”字法铺匀细胞(一般培养皿在台子上画 30 个 8 字即可铺匀)，最后在显微镜下检测是否铺匀细胞。

8) 确定293T人胚肾细胞已铺匀后，再把培养皿放入 CO2 培养箱培养。(尽量平直放入不要晃动)。第二天再观察细胞密度。

293T人胚肾细胞冻存方法

1) 准备工作：紫外线照台 30min，准备好细胞培养所需试剂物品：培养液，胰酶，PBS(试剂提前拿出 37℃预热或者常温放置半小时以上)；传代用培养皿，巴士管，离心管(已灭菌)，枪头(已灭菌)，移液枪，废液缸。检查离心机，废液泵;

2)从培养箱拿出293T人胚肾细胞，在显微镜下观察293T细胞密度和细胞状态，待细胞生长状态良好且存活率高的状态下，细胞密度达 80–90%时，可进行细胞冻存操作，以T25 瓶为例

293T人胚肾细胞冻存步骤

a.收集细胞及细胞培养液，将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液， 在细胞冻存管上贴上细胞标签(细胞标签上包含：细胞名称、冻存日期、培养用的 培养基)。

c.将冻存管入库到-80 度冻存盒里，放置 24 小时后，即可移入液氮中保存，标记好入库位置和冻存日期。

293T人胚肾细胞冻存小贴士

若是不确定细胞的冷冻条件或者细胞比较特殊，在做冷冻保存的同时，也可以用10%DMSO+90%FBS冻存几管，或者冻存后隔天在复苏一管测试，以防止冷冻失败。

293T人胚肾细胞特点

a.293t细胞贴壁能力比较弱：293T细胞是贴壁细胞，但其贴壁能力比较弱，容易出现明显的成片脱落现象。比如：运输低温及震荡、在室温条件下静置时间过长、添加的培养基或其他试剂温度过低、培养时细胞密度过高、细胞聚集时未吹散、加液吹打时触碰了细胞表面等。

若脱落现象不严重应将细胞尽快放回培养基继续培养，若出现大片脱落的现象需要收集细胞重新消化吹散再接种。

b.细胞本身偏嗜酸性，培养基消耗较快：293T细胞在略偏酸性的环境下生长状态更好，在培养过程中需要时刻注意培养基的pH值。在细胞密度达到70%以上时，细胞培养基的消耗速度较快，需要时刻观察并及时换液。

c.细胞生长时聚集成岛：293T细胞生长时呈岛状聚集生长，会逐步向外扩散直到完全融合。

d.细胞聚集成团之后很难再吹散：293T细胞传代过程中一定要注意吹散细胞，同时接种的密度不可过高。密度过高容易使细胞抱团，导致难以再次吹散，会在培养器皿中形成类似于球状的聚集体贴壁生长。导致即使培养条件合适细胞也难以生长。

293T人胚肾细胞培养常见问题

1.到货的293T细胞脱落，如何处理?

293T细胞因为贴壁松散，若购买常温细胞，收货时有可能大部分细胞脱离培养瓶壁，显微镜下找不到细胞，只能看到肉眼可见的细胞团，是正常现象。

收到细胞后请先置于培养箱中稳定4-6h后再进行下一步处理，不建议放置培养箱过夜后处理。

处理步骤

a.将培养瓶内所有培养基转入无菌离心管，1000rpm离心4min收集细胞;

b.去掉上清，用PBS重悬细胞(以手摇离心管的方式重悬，不要用移液枪吹)，将细胞收集到一个离心管中，再次1000rpm离心4min;

c.去掉上清，加入1mL左右0.25%胰酶重悬细胞(还是以手摇离心管的方式混匀，不要吹细胞), 放入培养箱消化2min;

d.消化2min后，加入5mL完全培养基混匀终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞悬液，使细胞团分散，1200rpm离心3min;

e.去掉上清，加入6mL左右细胞相应的完全培养基混匀，视细胞量决定是1:2传代还是1:3传代(由于细胞运输有损伤，首次传代建议比平时养密度稍高);

f.显微镜下观察细胞是否有分散成单颗现象，若有明显很大的细胞团需要重复上述步骤二次消化;

g.第二天及时观察细胞贴壁情况，若贴壁细胞量过多，造成细胞堆积，贴壁24h后再次传代分瓶，若密度正常则继续生长，不建议换液贴壁48h后换液去掉不能贴壁的细胞。

2.293T人胚肾细胞传代后聚团严重?

原因分析

a.胰酶消化操作不当导致细胞聚团。消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团。

b.消化时293T细胞融合率太高，成片脱落，将不容易被吹散，容易聚团。

c.鉴于293T细胞贴壁疏松，普通0.25%胰酶消化时间控制10s-40s(不同胰酶牌子消化时间不同);吹打动作轻柔，充分分散;细胞融合率达到80%-90%即可传代，不可长的太满。

d.细胞培养基中存在的成分：一些细胞培养基的成分可能促进细胞的聚集，例如含有过多的胶原蛋白或其他黏附蛋白。

e. 细胞质粘附不良：有些细胞可能由于细胞表面蛋白或黏附分子的缺失导致粘附能力下降，从而容易聚集在一起。

f 培养条件不当：细胞培养过程中的pH、温度、气体条件等因素如果不适当可能会导致细胞聚集。

g. 感染或污染：细胞培养过程中的感染或污染可能导致细胞产生异常反应，包括聚集在一起形成团块。

3.293T人胚肾细胞换了血清批次后聚团严重?

原因分析

血清批次间存在差异。293T细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能是由于受到血清里的某些因子刺激。

先用血清试用装，试用效果好，可购买和血清试用装批次相同的正装，有效避免批间差对细胞的影响。

4.293T人胚肾细胞转染病毒后凋亡严重?

在排查了方法步骤和转染试剂，依然没有改善的情况下，可排查一下转染前的营养体系，尤其是血清批间差带来的影响。前期培养细胞形态正常，其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标，还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定(比如倍增时间，存活率)。

通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。

5.293T人胚肾细胞培养要点

293T人胚肾细胞贴壁性较差，容易飘起来，37℃静置可重新贴壁。换液时注意不要用力摇晃培养瓶，否则有可能会把细胞摇下来。

293T人胚肾细胞容易消化，消化下来的细胞容易成团，要吹打吹散。否则传代后细胞会成团生长，不均匀，影响实验结果。

当293T人胚肾细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

细胞贴壁松散，操作时应轻拿轻放;PBS润洗时动作应缓慢，避免冲走细胞;

细胞传代第二天可能有轻微聚团现象，再长一天能长开，不建议传代第二天换液，以免损失细胞。

随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等情况。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

293和293t细胞区别

什么是 HEK293?

HEK293 是一种永生化细胞系，来源于人胚胎肾脏，用剪切的人腺病毒 5 型 DNA 转染以产生许多重组蛋白。HEK293 刚开始是由荷兰生物学家 Alex Van der Eb 于 1973 年从人类肾脏细胞中分离出来的。这些细胞是在女性胎儿的组织培养物中生长的。后来，Van der Eb 实验室的博士后研究员 Frank Graham 对它们进行了剪切的人类腺病毒 5 型 DNA 转染。该细胞系之所以被命名为HEK293，是因为这是弗兰克的第293次实验。

将腺病毒基因整合到 HEK 细胞基因组中，使这些细胞能够非常有效地产生大量重组蛋白。此外，腺病毒载体含有CMV启动子区;因此，它进一步提高了效率。该细胞系已被用作基因表达研究的宿主。

什么是 HEK293t?

HEK293t是源自HEK293原始细胞系的子代细胞系，转染携带SV40复制起点的质粒载体，产生大量重组蛋白。HEK293t 是一种表达 SV40 大 T 抗原突变体的人类细胞系。HEK293t 是在斯坦福大学 Michele Carlos 的实验室通过稳定转染 HEK29E 细胞系和编码 SV40 大 T 抗原的温度敏感突变体的质粒而创建的。它初被称为 293/tsA1609neo。这是因为转染用于创建赋予新霉素抗性和 SV40 大 T 抗原的 tsA 1609 等位基因表达的细胞系。

由于 SV40 大 T 抗原的突变版本的表达，具有 SV 40 复制起点的转染质粒可以大大增加重组蛋白的量。该细胞系通常用于生物技术行业的蛋白质表达和重组逆转录病毒的生产。

HEK293 和 HEK293t 的相同之处

转染通常被定义为将外来DNA和RNA引入细胞以影响其基因型和表型的过程。通过各种生物、化学和物理方法引入外来核酸可以改变细胞的特性。这允许在细胞环境中研究基因功能和蛋白质表达。HEK293 和 HEK293t 是两种细胞系，由于它们具有转染倾向，多年来在细胞生物学研究中得到广泛应用。

HEK293 和 HEK293t 是两种细胞系，由于它们具有转染倾向，因此被广泛用于细胞生物学研究，两者的相同之处在于：

两种细胞系都是实验室衍生的。

这些细胞系可以大大增加重组蛋白的产量。

它们是通过用质粒载体转染胚胎人肾细胞制成的。

HEK293 和 HEK293t 的区别

HEK293 是一种永生化细胞系，来源于人类胚胎肾脏，该肾脏被剪切的人类腺病毒 5 型 DNA 转染。相反，HEK293t 是源自 HEK293 原始细胞系的子细胞系，该细胞系转染了携带 SV40 复制起点的质粒载体。因此，这是 HEK293 和 HEK293t 之间的主要区别。此外，HEK293 不表达 SV40 大 T 抗原的突变版本。另一方面，HEK293t 表达 SV40 大 T 抗原的突变版本。

293T细胞的应用

作为一个称职的“工具细胞”，293T细胞的应用十分广泛：慢病毒包装生产及滴度测定，外源基因表达研究，蛋白表达研究，信号通路研究，抗体验证，药物筛选，条件培养基制作等，可以说，293T细胞是许多细胞科研工作者的入门细胞。

CRISPR/Cas9技术在293T细胞中的应用

CRISPR/Cas9技术作为目前大热的基因编辑技术，已经在293T细胞上得到了很好的应用，通过精准的基因编辑构建各类工程细胞系从而用于研究细胞凋亡研究，功能基因组学，信号传导途径，药物研发，药物抗性机制，药物反应和细胞疗法等。

CRISPR/Cas9技术在293T细胞中的具体案例

293T细胞助力研究PLAC8基因对KC细胞增殖和迁移的影响

癌基因胎盘特异性8(PLAC8)在细胞过程和人类疾病扮演着重要的角色，但对于PLAC8如何影响人肾癌(KC)细胞增殖和迁移的研究并不多。 因此Qin等人选择293T细胞作为研究对象，研究PLAC8对293T细胞增殖和迁移产生的影响。首先他们通过CRISPR/Cas9建立了两株PLAC8敲除(KO)293T细胞系，为了对293T细胞增殖和迁移过程中的PLAC8特征进行分类，他们通过细胞计数、集落形成实验(细胞增殖活性)、细胞周期，划痕实验和迁移试验等表型实验(源井生物可提供各类表型实验服务)，以及Westernblot对其分子机制进行了研究。结果表明，敲除PLAC8可抑制293T细胞增殖。此外，PLAC8-KO对293T细胞增殖的抑制作用与细胞周期中的G2/M相关，同时PLAC8-KO显著抑制细胞周期蛋白B1和升高细胞周期蛋白a。这说明PLAC8在293T细胞增殖和迁移中起着重要的作用，并为进一步研究PLAC8对人KC细胞的作用提供了重要的研究依据[1]。

293T细胞助力构建重组蛋白生产量化模型

293T细胞表达外源基因的能力是有目共睹的，已被认为是生产表达特定蛋白质产物的强大工具，并被广泛用于生产多种重组蛋白。然而，构建的工程细胞系的重组蛋白产量往往不一致，并且难以量化。Lo等人使用 CRISPR/Cas9 将人核糖体蛋白 L13A ( RPL13A ) 敲入到特定位点(图3)，这样转基因表达由内源性启动子驱动，以确保重组蛋白的一致和可预测的表达。还可通过从具有所需表达水平的基因中选择启动子来预先确定表达水平。为了量化重组蛋白的表达，蛋白质定量报告基因 (PQR) 被整合在内源基因和外源基因之间，PQR 等摩尔生产内源性蛋白质、重组蛋白质和荧光报告基因，这样就可用细胞的荧光强度量化目标蛋白的表达[1]。

293T细胞助力端粒酶活性抑制机制研究

所有持续增殖的细胞，如干细胞和癌细胞，都有一种补偿持续分裂过程中端粒磨损的机制。大多数情况下，这种要求是由端粒酶满足的。体细胞由于缺乏端粒酶活性无法无限分裂，但当细胞中TERT转录的重新激活后就会使它们能够继续分裂，这是肿瘤发生过程中的关键步骤。因此，研究TERT表达对于了解端粒酶活性水平在生理和病理条件下的调节机制具有重要意义。人类TERT基因启动子区域的两个点突变(C-124T和C-146T)在各种癌症类型中高度复发，并且与较高的端粒酶水平相关。 Xi 等人使用 CRISPR/Cas9 修改内源性TERT基因，用定位标签标记内源性 TERT 蛋白或。通过这种方法，他们生成了表达 FLAG-SNAP 标记的 TERT 蛋白的 293T细胞系，从而实现了内源性 TERT 的有效免疫纯化 (IP) 和亚细胞定位。结果表明，端粒酶在任何给定时间内只定位于少数端粒。他们还生成了带有修饰的TERT启动子的HEK 293T 和 SCaBER 细胞，这表明去除C-124T突变足以降低端粒酶水平并缩短端粒。这种方法不仅为研究端粒酶生物学提供了有用的工具，而且还提供了一种通用方法来纯化和可视化低丰度蛋白质，以及在低编辑效率的基因组位点进行单碱基对修饰[3]。

参考文献

[1] Qin, Xu-Hui, et al. "Knockout of the placenta specific 8 gene affects the proliferation and migration of human embryonic kidney 293T cell." Cell biochemistry and biophysics 78.1 (2020): 55-64.

[2] Lo, Chiu-An, Alexander W. Greben, and Brian Edwin Chen. "Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in." BioTechniques 62.4 (2017): 165-174.

[3] Xi, Linghe, et al. "A novel two-step genome editing strategy with CRISPR-Cas9 provides new insights into telomerase action and TERT gene expression." Genome biology 16.1 (2015): 1-17.