原代培养及永生化星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的分子和功能表征

前言

永生化胶质细胞株的建立对于研究神经系统功能和疾病具有重要的意义和必要性。胶质细胞是中枢神经系统的主要支持细胞，它们在维持神经系统的正常功能中起着关键作用，包括提供营养物质、调节神经递质、参与血脑屏障的形成和维护等。同时，胶质细胞也是许多神经系统疾病(如脑肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病等)的重要参与者。

然而，由于神经系统的复杂性和敏感性，直接获取和研究活体人脑中的胶质细胞一直是一个挑战。因此，科学家们通过细胞培养技术，建立了永生化胶质细胞株，这些细胞可以在实验室条件下无限期地生长和繁殖，为研究提供了便利。

通过永生化胶质细胞株，科学家们可以更深入地了解胶质细胞的生物学特性、功能机制以及其在神经系统疾病中的作用，从而为疾病的预防和治疗提供新的靶点和策略。例如，通过对胶质细胞的研究，科学家们已经发现了一些与神经系统疾病相关的基因和信号通路，这为疾病的诊断和治疗提供了新的思路。

今日推荐

今天推荐的是由南里奥格兰德联邦大学在2019年8月17日发表于Neurochemistry International(2021IF：4.1998，JCRQ1)的一篇文章，通讯作者是Marina Concli Leite教授，研究主要阐述了星形胶质细胞培养模型：原代培养、永生化星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的分子和功能表征。

研究背景

人们对星形胶质细胞的生理学及其在大脑功能中作用的认识在不断进步。原代星形胶质细胞培养是在一个孤立的系统中研究这些细胞的另一种方法：研究它们的生理和病理状态。细胞系通常被用作星形胶质细胞模型，因为它们更容易操作，速度更快，成本更低。然而，对这些细胞的不同特征进行评估的研究很少，这可能会对使用它们作为星形胶质细胞模型的有效性产生疑问。

摘要部分

本研究的目的是比较原代培养物(PC)与两种细胞系—永生化星形胶质细胞和C6细胞—在蛋白质表征、形态和代谢功能活性方面的差异。研究人员的结果表明，在相同的培养条件下，永生化星形胶质细胞和C6细胞的分化星形胶质细胞标志物(如GFAP、S100B、AQP4和ALDH1L1)均呈阳性，但表达量低于原代星形胶质细胞培养物。增殖细胞的谷氨酸代谢和细胞通讯能力降低。然而，与原代星形胶质细胞相比，C6系细胞的葡萄糖摄取量升高，这可能是由于它们的肿瘤来源和高增殖率造成的。永生化星形胶质细胞的生长速度低于C6细胞，其基底形态与原代星形胶质细胞相似。然而，事实证明它们并不是某些经典星形胶质细胞功能(如S100B分泌和GFAP含量)的良好繁殖模型，尤其是在受到刺激时。相比之下，C6细胞对刺激的反应结果与原发性星形胶质细胞相似。在此，研究人员对三种星形胶质细胞模型进行了功能比较，试图选择最适合研究星形胶质细胞的模型，优化这一知识领域的研究。

材料方法

1. PC、C6和IA的形态学评估、星形胶质细胞标记物的蛋白质图谱、细胞中的谷氨酸代谢、细胞中的葡萄糖代谢、缝隙连接通信。

用肌动蛋白、GFAP和S100B蛋白标记对细胞星形胶质细胞形态进行了评估(图1)。

图1.PC、C6和IA的形态学评估

PC和IA表现出相似的多边形，细胞进程较少。肌动蛋白标记显示这两种细胞都有有组织的细丝。相比之下，C6胶质瘤细胞呈细长体，肌动蛋白纤维弥散。与IA不同，PC和C6在10 μM福斯克林的刺激下出现了形态学改变。PC表现出星状特征，C6则表现出细胞体回缩，并伴有细长的突起。众所周知，发育过程中GFAP/波形蛋白比值的增加与星形胶质细胞的分化有关。在研究人员的研究中，IA和C6的GFAP/波形蛋白比率与PC相同，表明其分化状态相似(图2A)。在星形胶质细胞标记物方面，C6和IA呈阳性，但与PC相比，GFAP、S100B、ALDHL1和AQP4的水平有所降低(图2A、B、D和E)。有趣的是，Kir4.1在所有测试的细胞模型中都显示出相似的水平(图2F)。谷氨酸代谢是通过测量谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸转运体(EAAT1和EAAT2)的含量以及GS活性和谷氨酸摄取量来评估的。

图2.PC、IA和C6中星形胶质细胞标记物的蛋白质图谱

所有这些指标在IA和C6细胞中都有所降低(图3A-E)。有趣的是，PC、IA和C6细胞产生的GSH含量相当，而GSH是星形胶质细胞中的主要抗氧化剂，其生物合成也取决于谷氨酸含量(图3F)。葡萄糖代谢是通过测量葡萄糖转运体和摄取来评估的。

图3.PC、IA和C6细胞中的谷氨酸代谢

在这些分析中，C6神经胶质瘤细胞的葡萄糖摄取率高于PC和IA(图4A)。尽管如此，与PC相比，IA和C6的葡萄糖转运体(GLUT-1)含量水平较低(图4B)。星形胶质细胞的交流对其许多功能至关重要。

图4.PC、IA和C6细胞中的葡萄糖代谢

通过分析星形胶质细胞培养物中表达最丰富的连接蛋白--连接蛋白-43的含量以及使用荧光黄染料进行的废料负载试验，对这种通讯进行了评估。这两项分析表明，与PC细胞相比，IA和C6细胞的间隙连接通讯受损(图5A和B)。考虑到三种模型的星形胶质细胞在基础蛋白谱方面存在差异，研究人员想知道它们在相同的刺激下是否会有不同的反应。研究人员使用了描述良好的刺激来干扰星形胶质细胞的功能。在葡萄糖和谷氨酸摄取以及TNFα分泌的刺激下，三种细胞模型的反应相似。然而，在S100B分泌、GS活性和GSH含量方面，IA不受刺激影响，这与PC和C6的反应相似。有趣的是，在PC中观察到的LPS刺激下GFAP的增加在IA和C6中都没有显示出来。根据MTT还原试验，在所有刺激下细胞的活力都没有受到影响。

图5.PC、IA和C6中的缝隙连接通信

研究结论：PC、C6和IA的形态学评估、星形胶质细胞标记物的蛋白质图谱、细胞中的谷氨酸代谢、细胞中的葡萄糖代谢、缝隙连接通信。

结论与讨论

星形胶质细胞的形态和可塑性可能是调节细胞外微环境和突触活动的关键。在本研究中，基础条件下的形态学评估显示PC和IA具有相似的多边形。相比之下，C6细胞显示出纺锤形或三角形的细胞体和不规则的肌动蛋白网络，这与胶质瘤的侵袭性有关。虽然在研究人员的研究中使用了高通量的C6细胞，但这些细胞来源于肿瘤，可能保留了转化细胞的某些特征。

在通常会诱导细胞内cAMP含量增加的福斯可林刺激下，PC如预期一样表现出细胞体回缩和突出的长突起。在相同条件下，C6表现出细胞体回缩，但与PC相比，C6的突起稀疏且较细。尽管IA在形态上与PC相似，但它们不受福斯可林刺激的影响。有趣的是，原代星形胶质细胞在亚培养后会失去突触，这可能是内脏无反应的部分原因。与研究人员的研究结果类似，二丁烯酰-CAMP在永生细胞系中也不会像在C6和PC中那样诱导GFAP上调。此外，星形胶质细胞肥大高度依赖于GFAP含量，而GFAP含量在系细胞中已被证明会减少，本研究也证实了这一点。总之，研究人员的结果表明，IA的形态可塑性可能会受到影响，因此该细胞系不适合作为评估模型。

星形胶质细胞是功能性和分子异质性细胞。不过，它们有一些蛋白质标记，如S100B和GFAP。C6和IA对这两种标记物均呈阳性，但数量明显少于PC。以前在其他研究中也观察到类似的结果。除了这些标记物，研究人员还评估了ALDH1L1蛋白，它已被用作一种新的星形胶质细胞标记物。虽然这种蛋白参与叶酸代谢，干扰细胞分裂和生长，但与PC细胞相比，IA和C6细胞的ALDH1L1水平有所降低。在星形胶质细胞膜上广泛表达的AQP4水平也出现了同样的结果。

IA和C6细胞中重要星形胶质细胞标志物水平的降低可能是由于它们的高增殖性。从这个意义上说，这两种细胞系可能更多地合成与细胞增殖相关的蛋白质，而不是特定的星形胶质细胞标志物。众所周知，细胞内任何特定蛋白质的水平都是动态的。基因表达可能随细胞密度或细胞周期转换时间而变化。例如，在汇合细胞中，与增殖相关的基因会减少，或者与细胞分化相关的基因会上调。增殖能力的减弱可能会使细胞处于更加分化的状态。因此，在本分析以及其他使用这些细胞模型的研究中，保持汇合模式以达到基因表达的稳定性非常重要。

有趣的是，Kir4.1通道也是一种神经胶质特异性蛋白，在所有测试的细胞类型中都显示出相似的含量。然而，在胶质瘤中，钾传导已被证明因细胞核膜定位而非细胞膜定位而受损。因此，相似的蛋白表达并不一定代表Kir4.1的功能。

星形胶质细胞中的谷氨酸代谢受损可能会影响谷氨酸-谷氨酰胺循环和许多大脑功能，这在神经退行性疾病中也能看到。最近的研究表明，星形胶质细胞对谷氨酸的摄取取决于GS的活性，而GS的活性可确保有效清除EAATs捕获的谷氨酸。因此，研究人员的分析没有像早期研究那样只观察表达，而是评估了这种清除机制的功能。研究人员发现，与PC细胞相比，IA和C6细胞中的谷氨酸代谢减少。虽然谷氨酸转运体在细胞系中的基础表达与PC差别不大，但其功能却极低，这表明在这些细胞中，EAAT1和EAAT2在质膜中的位置可能很差。值得注意的是，其他研究没有在系细胞中检测到谷氨酸转运体，但这是在C6低传代细胞中进行的分析，与研究人员的细胞不同，研究人员的细胞至少经过了100次亚培养。C6从胶质瘤模型转变为分化星形胶质细胞模型的机理尚不清楚。有趣的是，在谷氨酸刺激下，EAAT2的过表达会降低C6细胞的增殖率，这表明谷氨酸转运体与细胞增殖之间存在负相关。

GSH的产生使星形胶质细胞在大脑中具有很强的氧化防御能力，所有测试的细胞类型都显示出相似的GSH含量。众所周知，GSH的产生取决于谷氨酸的含量。考虑到IA和C6细胞的谷氨酸摄取量和GS活性均低于PC，研究人员可以认为谷氨酸在这些细胞系中主要用于产生GSH。因此，这些途径在PC、IA和C6细胞中可能受到不同的控制。与此观点相印证的是，与正常星形胶质细胞相比，Xc-半胱氨酸/谷氨酸拮抗剂系统在胶质瘤细胞中过度表达，从而促进了它们的生长、存活和扩增。此外，高GSH的产生可保护胶质瘤细胞免受增殖细胞高氧化代谢的影响。

星形胶质细胞是大脑能量平衡的关键因素。星形胶质细胞捕获的大部分葡萄糖都被输送到糖原储存库和/或转化为乳酸供神经元输出。虽然与PC细胞相比，星形胶质细胞中的主要葡萄糖转运体(GLUT-1)在IA和C6细胞中表达不足，但C6细胞对葡萄糖的摄取更为明显(图4)。众所周知，肿瘤衍生细胞存在沃伯格效应，即糖酵解是主要的能量生成方式。因此，它们比正常细胞消耗更多的葡萄糖。因此，之前的一项研究表明，与正常星形胶质细胞相比，C6胶质瘤细胞利用更多的葡萄糖，产生更少的乳酸。有研究认为，葡萄糖可能被用于另一条途径，如磷酸戊糖分流，这增加了谷胱甘肽还原酶活性产生的NADPH和GSH含量。因此，能量代谢的增加在增殖细胞中很常见。

葡萄糖等代谢底物可穿过星形胶质细胞间隙连接，这种沟通与增殖速度成反比。肿瘤细胞系通常不存在间隙连接，其存在会受到肿瘤促进分子的抑制。事实上，众所周知C6的细胞通讯水平很低，这与研究人员的研究结果和之前的研究中看到的Cx43的低表达是一致的。有趣的是，间隙连接通讯的增加会降低C6细胞的葡萄糖摄取量和增殖率。同时，内皮素对间隙连接的抑制会刺激GLUT-1从细胞内池内转运到星形胶质细胞的质膜并上调。因此，除了沃伯格效应，间隙连接也可能在增殖细胞的葡萄糖摄取调节中发挥重要作用。

当不同的星形胶质细胞培养模型接受相同的处理时，文献中发现了一些相互矛盾的结果。这些不同的结果给分析带来了困难，并对模型的有效性产生了怀疑。因此，研究人员测试了三种不同的星形胶质细胞培养模型对相同处理的反应。为此，研究人员使用了文献中已知的能引起原代培养物功能变化的刺激物。值得一提的是，培养反应的变化也可能受到培养程序差异的影响，如培养基成分、培养板涂层和体外培养天数。这些差异可能会干扰基因表达和形态变化。事实上，最近的研究表明细胞外基质的组成决定了星形胶质细胞对机械和炎症刺激的反应。在这项工作中，研究人员对所有三种培养模型采用了相同的程序，以确保观察到的处理效果是由于生物细胞的变异造成的。总体而言，研究人员的研究结果表明，PC和C6细胞对相同刺激的反应相似，特别是在S100B分泌、GSH含量、谷氨酰胺合成酶活性、葡萄糖和谷氨酸摄取以及TNFα分泌方面。因此，虽然它们的基础蛋白量往往不同，但这些途径的激活似乎是相似的，至少对测试的刺激是如此。相比之下，IA的反应性较低，表明这种转染克隆不是研究星形胶质细胞某些特征的良好模型。最近的研究表明，在不同传代中表达的p53同工酶调节星形胶质细胞介导的神经保护和神经退行性变。因此，具有p53抑制作用的IA(由于转染过程)可能会影响其功能。值得注意的是，IA保留了对谷氨酸和葡萄糖摄取的反应，以及TNF α的分泌。

根据研究人员的数据，虽然PC技术耗时较长、成本较高，但将其用作星形胶质细胞研究的繁殖模型无疑是首选。不过，C6细胞系虽然有一定的局限性，但似乎也能在很大程度上再现星形胶质细胞。总之，这项工作确定了每种培养类型的局限性和优势，对星形胶质细胞的功能进行了全面综合的比较，优化了这一知识领域的研究。此外，该研究还强调了针对每种相关刺激验证细胞培养模型的重要性，以便在无法使用PC时选择合适的细胞模型。