小鼠星形胶质细胞 （Astrocytes）分离培养

背景简介

星形胶质细胞(astrocyte)，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。

细胞形态

小鼠神经星形胶质细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形，细胞可传5代左右；3代以内状态最佳。

小鼠神经星形胶质细胞原代培养

小鼠神经星形胶质细胞传代培养

细胞特点

1. 机械支持和营养作用

填充神经元和血管之外的空间，并能分泌神经营养因子，有利于神经元的生长、发育、存活和发挥功能。

2. 隔离、绝缘和屏障作用

防止邻近的神经元相互干扰，且参与形成血—脑屏障，对物质的运输有一定选择作用。

3. 修复和增生作用

用以填充因缺氧、外伤或疾病等发生变性并清除后留下的组织缺损，不过值得一提的是，星形胶质细胞增生过强，往往可形成脑瘤，成为引起癫痫发作的病灶。

4. 免疫应答作用

即星形胶质细胞的胞膜上表达的MHC II(一种与免疫相关的复合分子)可与经过处理后的外来抗原结合，将其呈递给T淋巴细胞。

5. 迁移引导作用

引导发育中的神经细胞迁移到定居部位。

6. 稳定CNS中K+和H+浓度

通过吸收K+和H+来阻止细胞外液中这两种离子的浓度增加，并可通过细胞间的缝隙连接将其分散到周围其它的星形胶质细胞，

材料准备

1. 工具

小鼠神经星形胶质细胞基础培养基Astrocyte basal Medium (ABM)、HBSS缓冲液缓冲液、PBS磷酸缓冲液、75%酒精、多聚赖氨酸、尖头镊、弯镊、剪刀、冰盘、10 cm培养皿、6 cm 培养皿。

2. 提前开启紫外线照射超净台30min

将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 min。HBSS缓冲液缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 min以上。

3.包被培养皿

将10x的多聚赖氨酸稀释成1x的工作液，将培养瓶底部加满。过夜或两小时，结束后，使用PBS缓冲液洗2-3次备用。

小鼠星形胶质细胞分离培养操作步骤

1. 取3个10 cm 培养皿，3个6 cm 培养皿倒入HBSS缓冲液,置于冰盘上。

2. 取出生2天内的新生鼠，泡入装有75%酒精的离心管内。

3. 待小鼠死亡后，在1中漂洗2-3次。

4. 取脑子：用尖头镊剥离鼠头部及脑壳，取出脑子，放入6 cm培养皿。

5. 剥脑膜：将一个脑移至一个新的6 cm 培养皿(两三个脑子用一个6 cm培养皿，防止太久HBSS缓冲液升温)，在解剖镜下去除嗅球，小脑及两个大脑半球中间的连接物，将剥干净的皮层放入新的6 cm培养皿。

6. 将剥离好的皮层夹碎至浆糊状，组织使用神经星形胶质细胞完全培养基稀释，准备铺入包被的培养瓶。

T75培养瓶3个脑袋，大培养瓶 4-5个脑袋。

7. 每3-5天换液，一般12天左右长满，长满后开始传代。

细胞标志物鉴定

小鼠神经星形胶质细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。

小鼠星形胶质细胞(Astrocytes)纯化

1.差速贴壁法纯化星形胶质细胞

P0细胞消化后，铺皿1h贴壁后下层细胞中GFAP阳性的星形胶质细胞所占比例较大，未贴壁的悬浮细胞数量逐渐减少。

2.摇培

原代细胞培养至第 3d， 将细胞培养瓶置于无菌 37 ℃ 恒温摇床上， 260 r/min 震荡处理 2 h，用吸管吸取培养液轻轻吹打瓶底， 尽量去除震荡后贴壁不牢的其他杂细胞， 然后将瓶内培养液1 000 r/min 离心 5 min， 上清液重新转移至原细胞培养瓶内， 同时补入 2. 0 ～ 3. 0 mL 新鲜培养液。

研究应用

揭开分子和机制的面纱

对星形胶质细胞基因和蛋白质表达进行全面的分析，有助于揭示复杂现象，并为探索实验提供初步指导。目前已有几种星形胶质细胞转录和翻译谱的相关研究，包括使用体外培养的星形胶质细胞分子图谱进行早期评估、体内星形胶质细胞分子图谱的选择性基因靶向研究、以及单细胞水平星形胶质细胞的分子特征。

基因靶向

总结了用于星形胶质细胞研究的主要小鼠品系及特性，包括表达Cre重组酶的品系以及病毒载体。目前，最可靠的小鼠品系是Aldh1l1-Cre/ERT2，最可靠的病毒是将AAV2/5与GfaABC1D启动子结合使用。

探索形态学

可靠地观测和跟踪星形胶质细胞形态学变化至关重要。总结了星形胶质细胞在不同尺度下的形态学研究方法。

目前的主要挑战是开发实时成像方法，这依赖于组织固定方法、自动化示踪技术以及机器学习等。仍有许多问题待解决。

探索钙信号

与目前已经开发出多种针对Ca2+、神经递质和神经调节剂的基因编码传感器，未来更多传感器的开发将使研究人员能够直接监测星形胶质细胞Ca2+的下游效应。

治疗的干预途径

针对神经退行性变中的星形胶质细胞的多种治疗策略已经被提出。这些策略包括基于星形胶质细胞富集靶点建立的药理学方法、使用药物或基因手段靶向星形胶质细胞中的通路、靶向转录因子修改星形胶质细胞中特定基因或蛋白质的表达、将健康的星形胶质细胞移植到受神经退行性变影响的区域或将星形胶质细胞转化为神经元以取代受损细胞。