NK细胞高效分离培养

背景简介

NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，NK细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，约占血液中所有免疫细胞(白细胞数量)的15%，属于天然免疫系统的核心细胞。

NK细胞存在于大多数器官(骨髓、肺、淋巴结、外周血、脾脏和肝脏)。NK细胞也被描述在许多其他器官中，如肠、皮肤、膀胱、扁桃体、子宫、胸腺、肾脏、胰腺、脂肪组织，甚至在小鼠大脑中。

细胞形态

细胞特点

1. 免疫监视

NK免疫细胞能高度识别、监视体内细胞病变，防止超敏反应，执行免疫监视。

2. 清除病原体

防止邻近的神经元相互干扰，且参与形成血—脑屏障，对物质的运输有一定选择作用。

3. 抗衰老

免疫细胞可诱导老细胞凋亡，促进信息报产生，提升精力、体力、延缓衰老。

4. 杀伤肿瘤细胞

NK 细胞是机体重要的免疫细胞，可靶向性杀伤肿瘤细胞，是未来治疗肿瘤的体细胞。

实验介绍

本实验室采用独有的细胞因子培养法，将外周血中的单个核细胞进行诱导。经过14天的诱导培养CD3-/CD56+NK细胞绝对数量可扩增达到1000倍，其纯度可达80%以上

材料准备

仪器：离心机、显微镜、计数器、水浴锅、恒温培养箱。

试剂：人外周血淋巴细胞分离液、清洗液、NK细胞基础培养基、NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E。

耗材：10 mL移液管、15 mL离心管、采血管、T75培养瓶、T175培养瓶。

操作步骤

提前开启紫外线照射超镜台30分钟，超镜台通风10分钟以上，水浴锅提前开启加热至56℃，提前准备好移液管、T75培养瓶、人外周血淋巴细胞分离液、清洗液、NK细胞基础培养基、因子、1 mL枪头、200 μL枪头、移液枪、15 mL离心管，提前从冰箱取出放置室温。

(一)单个核细胞分离

血液样本量为10 mL，取两支15 mL离心管各加入5 mL分离(液与血液体积相同)用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500转离心20分钟(分离PBMC时离心转速设置为慢升慢降，升为9，降调为0)离心后，此时离心管中由上至下分为4层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。收集血浆到新的离心管中血浆56℃30分钟灭活900转离心10分钟取上清置于4℃保存，用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个和细胞层到另一个50 mL离心管中，向所得离心管中加入10 mL清洗液混匀细胞，300转离心10分钟，弃上清用吸管以10 mL清洗液重悬所得细胞300转离心10分钟，之后重复进行清洗步骤。弃上清后以0.5 mL后续实验所需相应液体重悬细胞。

(二)NK细胞培养

D0天：约用10 mL NK基础培养基，培养基加入因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆将制备好的单个核细胞(PBMC)重悬，按细胞密度1.0-2.0M cells/mL铺于T-75瓶中摇晃混匀后做好标记，放入培养箱中进行培养。

D4天：补加10 mL培养基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆)此时瓶子含20 mL培养基做好标记后放,入培养箱中进行培养。

D6天：补加20毫升培养基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆)此时瓶里含有40 mL培养基做好标记后,放入培养箱中进行培养。

D8天：往培养瓶补加40 mL培养基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和1%自体血浆)同时加入因子NK-E将培养液转移至T175瓶中，此时瓶子含80mL培养液做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D10天：往培养瓶补加80 mL培养基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自体血浆)此时瓶子含160 mL培养液做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D12天：往培养瓶补加160 mL培养基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自体血浆)此时瓶子含320 mL培养液，将培养液分至另一个培养瓶中做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D14天到15天:收获目的细胞

NK细胞培养注意事项

采血环节注意事项

1. 因为EDTA会影响免疫细胞的激活与扩增，采集血样时禁止使用 EDTA 抗凝的真空采样管。

2. 采血管选择：肝素钠采血管>枸橼酸钠采血管

3. 暂存：4度

血浆

1. 自体血浆灭活前可以加入8%葡萄糖酸钙注射液，减少血浆凝固、血浆添加后细胞出絮等问题。

2. 灭活后的自体血浆在4℃冰箱保存即可，请在一个培养周期内使用完毕。

3. 培养中后期自体血浆不足时，可以选用AB血浆

4. 不建议使用人血清白蛋白替代，其中营养物质较少，效果较差

血小板、红细胞混入问题

1. 部分外周血在提取PBMC的过程中，白膜层可能会存在一些红细胞，吸取时应尽可能避开有红细胞部分。

2. 若不易区分，则接种PBMC应稍加大接种量。

3. 不建议加入红细胞裂解液等，对免疫细胞的活性、增殖能力存在较大影响。

培养基配制及补液

1. 每次补液时添加的培养基需预温，用多少取多少，禁止将整瓶培养基预温、禁止反复预温。

2. 培养基现配现用，配成完全培养基后4°保存。

1. 使用经过TC处理的细胞培养瓶。

2. 尽可能使用大体积的培养袋，促进细胞间的气体交换，防止代谢废物过多影响细胞增殖。

3. 如采用1L培养体系，推荐使用2L培养袋;采用2L培养体系，推荐每个1L体系使用1.8L培养袋。

4. 刚入袋时，一般细胞培养袋大而细胞液体积小，建议将培养袋对折使用(d7)，选择合适的底面积培养。

5. 接种密度：外周血的推荐接种密度为1.5-2E6cells/mL;

1. 细胞接种后，第1-3天会形成悬浮细胞小团，第3-5天绝大部分悬浮细胞团贴壁，不可将其晃起，第5-7天贴壁的细胞团变大、变多，这些都是正常的细胞形态。

2. 培养前期一定不要吹打细胞团(D0-D5)，以减少细胞机械损伤。

NK细胞鉴定

NK细胞培养常见问题解答

1.问：NK细胞成团分布，如果不吹打细胞团，会引起细胞老化吗?

1.答：NK细胞成团分布是一种非常正常的细胞形态，不吹打不会引起细胞老化。如果细胞团过大，可以在镜下观察，如果细胞团内部呈现一种透亮的状态，说明团块内部营养物质很充足。如果团块呈现出漆黑的状态，此时可以适当考虑把细胞团块吹散。

2.问：分离单个核细胞时，红细胞掺杂比较多，怎么改善?

2.答：分离时有时会存在红细胞掺杂比较多的问题，红细胞会在5～7天时皱缩凋亡，但是它会影响单个核细胞的计数。

一般有两个处理方案：(1)对样本下层红色液体，按照1:2的比例采用缓冲液进行稀释;(2)取少部分细胞悬液，做红细胞裂解，从而达到对单个核细胞精确计数的目的。

3.问：PBMC里的NK细胞冻存复苏后为还能继续扩增吗?

3.答：免疫类细胞的复苏静默期较长，一次冻存对于细胞质量的影响非常大。培养完成的NK量非常大，经过冻存后较难恢复到新鲜效果，成体NK细胞一般是直接用于临床。

4.问：换瓶或转袋时，旧培养瓶中残留细胞如何处理?

4.答：当培养体积不断扩大后，需要进行换瓶或转袋处理。将细胞悬液转移至新容器后，原培养瓶在显微镜下观察通常能看到瓶壁上仍附有较多细胞和细胞团，可在原培养瓶中添加适当新鲜培养基(无需添加血浆)，继续培养1-2天后可观察到大量细胞或细胞团已悬浮在培养液中，此时可将这些细胞悬液转移合并回到正常体系培养瓶或培养袋中。旧培养瓶中培养1-2天后仍无法脱落的细胞直接丢弃。

NK细胞的应用

预防肿瘤

1. NK细胞的活力和功效随着年龄的增长逐渐降低

2. 随着年龄的增长，人体免疫力逐渐减弱，肿瘤发病率逐年提高。

3. NK细胞是免疫细胞的一种，被医学界公认为“抗癌第一道防线”

4. NK细胞可以通过释放穿孔素、颗粒酶、抗体介导的细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，而对正常的细胞没有任何伤害。

抗衰老

1. NK免疫细胞不仅可以清除癌变、病变细胞，还具有清除衰老细胞、病毒和自由基的功效。

2. NK细胞能够提升人体免疫力，抵抗衰老，改善睡眠，全面改善新陈代谢功能。

预防乙肝病毒

NK细胞治疗可以直接清除HBV,还可以清除被病毒感染的肝细胞。通过定期回输激活后的NK免疫细胞，进行NK细胞抗病毒，可以预防病毒性肝炎进一步恶化成肝硬化和肝癌。

保护呼吸系统

NK免疫细胞能显著减轻肺部的炎性反应，清除肺部病变的细胞，为根本性预防肺部疾病带来了希望。

预防生殖系统炎症

NK免疫细胞在修复全身各器官衰老的同时，能显著地修复生殖系统的衰老退化，恢复和加强男性和女性性功能。

恢复皮肤弹性，再现青春容颜

NK细胞通过清理衰老细胞、促进新陈代谢，具有显著的美容美肤和美发效果。NK细胞能使松弛下垂的皮肤光滑收紧，恢复皮肤弹性，减少皮肤皱纹和色素沉着。

NK细胞疗法临床试验

据统计，全球 NK 相关的细胞疗法临床试验数量达 283 个。