huvec细胞血管形成实验及常见问题

huvec细胞血管形成实验背景简介

HUVEC 是从脐带静脉内壁分离出来的原代细胞。内皮细胞常用于研究低氧、炎症、氧化应激、感染反应及正常和肿瘤相关血管生成等应用。

血管生成(Angiogenesis)是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。多种类型的内皮细胞均可用于本实验，包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能，理论上可以传代50-60次。

HUVEC细胞形态

HUVEC细胞特点

① 来源方便

HUVEC来源于新生儿的脐带组织，容易获取，没有伦理争议，且便于提取足量细胞。从人脐静脉细小的血管组织中分离出内皮细胞，原代提取及培养工作量大。

② 具有细胞成管的能力

此为内皮细胞最基本的特征。

③ 原代HUVEC最接近人自体内皮细胞，体现新生血管内皮的特点。

材料准备

ECM内皮细胞专用培养基，DMEM培养基，基质胶，胰酶，PBS磷酸缓冲液

操作步骤

A.准备基质胶

1. 实验前一天将基质胶置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使胶能过夜缓慢融化。(注意：同样要准备一些4℃预冷的枪头用于吸取基质胶)

2. 开始实验前，将基质胶始终保持放在冰盒中。

3. 冰上操作。基质胶用预冷枪头混匀。

B.铺基质胶

由于每一批基质胶浓度会有差异，建议使用前做1:1及2:1的稀释，操作如下：

提前将96孔板和枪头预冷，准备两个预冷1.5 mL离心管用于稀释基质胶。按照想要的比例，稀释完基质胶后，于每孔中加入50 µL 基质胶，避免产生气泡。在37℃培养箱中放置45 min-1 h。(注意枪头要垂直于内孔的正上方加入基质胶，防止有基质胶流经孔壁而留下残留胶。若是孔的底部没有铺满胶，可以晃动一下96孔板，使底部铺胶均匀)例如：铺原胶、稀释1倍、稀释0.5倍时，用DMEM稀释。

C.铺细胞

1.当HUVEC细胞长满70~80%时，消化下来，并用含10%FBS的DMEM 重悬，计数，使每孔加入50µL重悬液，浓度为30000个细胞/孔，重复三孔。(注意保持枪头垂直在孔的上方，不要接触到下面的凝胶。)

2.37℃培养箱孵育，四小时后可见血管形成。

HUVEC细胞血管实验常见问题

1.稀释基质胶用什么稀释?

用不加双抗、不加胎牛血清的高糖的DMEM培养基稀释。

2.怎么样铺胶均匀?

枪头要垂直于内孔的正上方加入基质胶，防止有基质胶流经孔壁而留下残留胶。若是孔的底部没有铺满胶，可以晃动一下96孔板，使底部铺胶均匀，若还是没有均匀，可用枪头稍微搅动一下。

3.进行血管形成实验，应该选用多大浓度的基质胶呢?

最低浓度应不低于10mg/mL， 基质胶的稀释比例是6 mg/mL以上。成管效果最好的是6-8 mg/mL

HUVEC细胞标志物荧光鉴定

HUVEC细胞成管实验