huvec人脐静脉内皮细胞培养方法和常见问题

HUVEC人脐静脉内皮细胞永生化细胞背景简介

1984年，HUVEC细胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan从一段长约10-20cm的人正常脐带静脉中获取、建立。

SetsukoShioda等人研究发现，HUVEC细胞株18-30代的倍增时间为23.5个小时，24-27代的倍增时间为67个小时，27-30代的倍增时间为84个小时，32-34代的倍增时间为100个小时。培养至40代后，细胞形态出现多样化，有些细胞变大或变小，有些细胞出现多核;细胞密度下降、倍增时间延长。最后细胞在第54代停止生长，ATCC的预期寿命也显示在50-60代。

2018年，Setsuko Shioda等人发现HUVEC细胞株(passage 31)在贴壁汇合时细胞与细胞之间存在间隙，这与典型的内皮细胞特征有所不同。

HUVEC人脐静脉内皮细胞永生化培养说明书下载

HUVEC细胞形态图

HUVECC ATCC细胞形态图

huvecs细胞的培养方法

huvecs细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头(白色0-10ul;黄色20-200ul;蓝色100-1000ul)、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

试剂：ECM完全培养基、PBS、消化液、冻存液。

HUVEC细胞复苏操作

1.将含有1 mL HUVEC细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。

2.在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。

3.将所有HUVEC人脐静脉内皮细胞(永生化)悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜)。

4.第二天换液并检查HUVEC人脐静脉内皮细胞密度。

HUVEC细胞传代步骤

HUVEC细胞培养条件

培养基：内皮细胞培养基础培养基+5% FBS+1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S

推荐传代比例：1:2至1:3

推荐换液频率：每2-3天换液一次

倍增时间：~23.5 hours

消化时间：常温消化2-3分钟

培养条件：气相：95%空气+5%CO₂，温度：37℃

HUVEC细胞传代方法

如果HUVEC细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗HUVEC细胞1-2次。

b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，使消化液浸润所有HUVEC人脐静脉内皮细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若HUVEC细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将HUVEC细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

备注：收到HUVEC细胞后第一次传代建议1：2传代

HUVEC细胞冻存步骤

冻存条件

冻存液：无血清冻存液，液氮储存

(即用型、无血清、无需程序降温)

细胞冻存密度：5×10^6~1×10^7/mL

HUVEC细胞冻存方法

待HUVEC细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

1.收集HUVEC人脐静脉内皮细胞，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。

2.根据细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10^6~1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

HUVEC细胞培养要点

1.HUVEC细胞培养难度较高，建议使用内皮细胞专用培养基。

2.建议细胞前三次传代中冻存部分细胞，后续遇到问题可重新复苏。

3.部分细胞传代后细胞内出现黑色小点，细胞间隙内出现少量颗粒物或者培养基中浮游着少量死细胞等均为正常现象，对细胞的增殖及试验无影响。

4.细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片，可以吸去细胞悬液后用PBS进行清洗;如若PBS清洗后未能清除的碎片，可以用胰酶消化细胞重新接种，如果碎片较多，建议用PBS多清洗几遍。

5.细胞传代处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作，也可视情况稳定。

6.注意此细胞为SV40病毒转染构建的永生化细胞，细胞需要使用ECM专用的培养基。

7.HUVEC细胞培养过程中，需要每两天弃掉旧的培养基清洗并更换新的培养基，换液频率要维持较高水平，以保证细胞的正常扩增。

HUVEC细胞培养常见问题

HUVEC细胞必须用专用培养基吗？

HUVEC细胞用普通培养基的话，还要添加生长因子，常见的有ECGF/ECGF，ECGF，但价格贵，不如专用培养基来的划算，故推荐使用专用培养基。

HUVEC细胞系换液第二天出现空泡化？

可能原因

1. 是培养液的pH值与细胞正常所需pH值差别太大，导致细胞代谢异常，出现空泡化;

2. 是在细胞培养过程中，由于血清浓度不够、药物作用、外界刺激等情况下导致细胞代谢出现问题，内质网应激状况下会出现细胞空泡化的情况。

解决细胞空泡化方法

1. 测定完培的pH，看其酸碱性是否适宜。多数细胞适宜的pH范围为7.2-7.4。

2. 若培基或血清是开封存放很久的，可换用新鲜的完全培养基给细胞换液；若都是新开封的，可换用新批次的基培或血配制培养液，给细胞换液观察。

HUVEC培养过程中出现聚团如何处理？

原因分析

可能由于培养板亲水性差或者血清中的促贴壁因子不足。

解决办法

1.培养瓶使用前一天使用明胶包被。

包被方法：以T25瓶为例，取用5ml明胶放入T25瓶，放置37℃下30分钟以上，后将多余明胶吸出。

2.提高培养液中基质胶浓度。

3.培养基使用ECM内皮专用培养基进行配置。