小鼠脾脏分选CD3+T细胞分离培养视频教程

背景简介

脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴细胞，占全身淋巴组织总量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难，故经常需要从其脾脏中获取大量的淋巴细胞。采用磁珠阴选获得高纯度CD3+T细胞，本法获得的CD3+T可直接可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。

小鼠脾脏分选CD3+T细胞分离培养视频教程

主要试剂

红细胞裂解液、分选 buffer、磁力架

小鼠脾脏分选CD3+T细胞分离培养操作步骤

1. 制备单细胞悬液： 在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于50 ml 离心管中， 500 g，离心 5 min。

2. 离心结束， 弃上清，加入 5 ml 红细胞裂解液(ACK) ，室温裂解 5 min， 再加入 20 ml PBS， 500 g，离心 5 min。

注意： 红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。

3. 离心完成后， 弃上清，将脾细胞重悬于 PBS，细胞悬液用 70 μm 细胞筛网过滤后，计数。 计数完成后， 500 g，离心 5 min。

注意：细胞悬液需要过细胞筛网，以除去组织和细胞团块，否则会影响后续细胞分选纯度。

4. 离心完成后， 弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×108 cells/ml。

注意：分选 buffer 为含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清(FBS)的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5%BSA 的 PBS， 需预先通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌。

5. 将 100 μl 细胞悬液(1×107 个细胞)加入无菌流式管底部， 再加入 2 μl Biotin-Antibody Mix，混匀后4°C 孵育 10 min。

注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架不同也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

6. 孵育完成后， 在流式管中加入 20 μl Streptavidin beads(使用前涡旋振荡重悬磁珠，确保磁珠完全重悬)，混匀后 4°C 孵育 10 min。

注意：如果分选更多细胞， 则按比例增加Beads用量。例如分选 5×107 个细胞， 在500 μl细胞悬液中加入10 μl Biotin-Antibody Mix和100 μl Streptavidin Beads。 如果分选少于1×107个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μl， 加入 2 μl Biotin-Antibody Mix 和 20 μl Streptavidin Beads。

7. 孵育完成后， 在流式管中加入 2.5 ml 分选 buffer， 用移液器上下混合吹打 5 次混匀(避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀)。

8. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上，静置 5 min。

9. 将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中(倾倒过程中流式管不要脱离磁力架)， 此细胞悬液中即包含纯化的小鼠 CD3+ T 细胞， 500 g，离心 5 min。 离心后弃上清，收集细胞。

10. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。