小鼠胚胎成纤维细胞分离培养及鉴定方法视频教程

小鼠胚胎成纤维细胞背景简介

小鼠胚胎成纤维细胞分离自胚胎；成纤维细胞(Fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的胚胎成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团;细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状;细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

小鼠胚胎成纤维细胞常用作ES细胞培养常用的饲养层细胞，能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子，故能有效地促进ES细胞的增殖并维持其未分化特性和多潜能性，且分泌效果优于外源添加的一些因子，而且可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境，故在研究哺乳动物ES细胞中得到广泛使用。

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主要试剂

小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基、小鼠胚胎成纤维细胞组织分离液、PBS磷酸缓冲液、眼科剪、镊子、玻璃平皿、75%酒精

小鼠胚胎成纤维细胞分离培养操作过程

1. 配鼠：每天18:00-19:00时将雌、雄小鼠按3:1比例合笼。第2天8:00时分笼，并观察雌性小鼠有无阴栓，有阴栓确定为怀孕，记0.5 d，并分开单独饲养。

2. 取孕13.5 d小鼠,断颈处死，置于体积分数为75%酒精消毒3 min。无菌打开孕鼠腹腔，可见腹腔两侧呈“V”字型串珠样子宫，用镊子提起子宫(不能碰到皮毛，以防污染)，并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织，剥离子宫。将子宫放入含有PBS的一次性无菌培养皿中，漂洗两三遍，去除淤血。

3. 用眼科剪和镊子去除胎盘、羊膜等胚胎外组织，取出胚胎放入另一平皿，用PBS洗涤，直到没有血迹为止。

4. 用眼科剪和镊子去除胚胎的头部、四肢及内脏，留取躯干部 (注:头部、四肢及内脏需去除干净)，将躯干部放入玻璃平皿中，用PBS洗涤1次

5. 用眼科剪将胚胎躯干部剪碎成糊状，加入5 mL PBS混匀移入离心管中，自然沉降3 min后，将上清液轻轻吸出弃掉。

6. 加入3 mL 组织分离液轻轻吹打后室温下自然沉降2 min，将上清液轻轻吸出弃掉。

7. 加入3 mL 组织分离液轻轻吹打后室温下消化3 min，将上部的单细胞悬液轻轻吸出放入另一离心管中，加等量小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基终止消化，重复消化两次。若还有未消化的组织，再加入3 mL 组织分离液轻轻吹打至完全消化，终止消化。

8. 混匀离心管收集所有细胞悬液，自然沉降1 min，将大块沉淀吸出弃掉。

9. 800 r/min离心5 min，弃上清，使用重悬至5 mL。计数，按5x106/瓶接种到T25培养瓶中，补足体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基，记为原代(PO)。37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养24 h，

10.24小时后，换液以去未贴壁的细胞及碎片，细胞融合至80%-90%时，消化，按 1∶3-1∶4 比例传代培养

小鼠胚胎成纤维细胞鉴定

1. 形态鉴定

刚分离的胚胎成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起;6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团;细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状;细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

2. 标志物鉴定

小鼠胚胎成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上

3. 饲养层制备

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备

人胚胎干细胞传代前1 d制备饲养层细胞

1.0.1%明胶水溶液加入培养瓶，覆盖培养瓶底部包被培养瓶，置37 ℃培养箱孵育2 h后备用。

2.取细胞融合率约90%的第2-4代小鼠胚胎成纤维细胞，弃原培养液，将2 mL含10 mg/L丝裂霉素C及体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基加入培养瓶，置37 ℃培养2 h。

3.弃丝裂霉素C，用PBS洗5次，每次2 min (动作要轻柔，以免细胞层脱落，必要时可在镜下观察细胞层有无脱落)。

4.加入0.25%胰酶2 mL消化，加入等体积的含体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞脱壁。

5.收集消化细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，加含体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基重悬，用血细胞计数板计数。

6.取出经明胶包被培养瓶，弃去明胶水溶液，以5.0×105个/瓶接种细胞，含体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基培养，备用。使用前需换用胚胎干细胞培养液。