小鼠滑膜成纤维细胞分离,鉴定及传代方法视频教程

小鼠滑膜成纤维细胞背景简介

小鼠滑膜成纤维细胞分离自滑膜组织，滑膜组织是位于关节腔内面的内衬结构，各种关节内疾病均会累及滑膜。而滑膜细胞是维持关节正常功能的重要组织结构，同时在各种关节疾患中也是主要病变部位。骨关节炎(OA)以关节软骨退行性变为特征，其病理改变累及关节的各个组成部分，但绝不仅局限于软骨，还包括软骨下骨、滑膜、半月板和韧带。各组成部分的病理改变相互影响，相互作用，共同加速关节的退变。滑膜细胞是构成滑膜层的最大细胞群体，是维持关节正常功能的重要组织结构，它包埋在颗粒状无定性的基质中，基质内有分散的纤维分布。滑膜由A型(巨噬样滑膜细胞)、B型(成纤维样滑膜细胞)以及C型(树突细胞样滑膜细胞)细胞组成。

小鼠滑膜细胞主要功能

① 滑膜细胞产生润滑液成分，并且与关节腔的吸收和血液/润滑液交换有关;

② 滑膜细胞增生，表现为不依赖于支持物生长，并且分泌大量的效应分子来促进炎症和关节损坏;

③ 是自身自分泌和旁分泌网络中效应因子的一部分。

小鼠滑膜成纤维细胞分离,鉴定及传代方法步骤

主要试剂

小鼠滑膜成纤维细胞专用培养基、滑膜组织专用消化液、PBS缓冲液

小鼠滑膜成纤维细胞分离操作步骤

1.滑膜组织的获取

小鼠(5-10w)断颈处死，置于 75%乙醇中消毒2min，剪开双后肢皮肤，用显微外科手术剪刀和子在关节的周围剪下滑膜组织(为白色海绵状，图 1A 所示)，需注意将其中“蛋黄样”黄色圆物去除(图 1B 中小图所示)。转移入含2mL DMEM 培养基的培养皿。

在该实验中，主要是采用髓关节周围的滑膜组织，但如欲获得更多的滑膜组织也可进行以下操作：

取下双后肢(不含足踝，应保留所有的肌肉组织)，置于含2mLDMEM 培养基的培养皿中。在体视镜下，用显微外科手术剪刀和镊子剪开小鼠胆窝内肌肉，剪下滑膜组织(图1C 中箭头2所示)，也需注意将其中“蛋黄样”黄色圆物去除(图1B 所示)，转移入另一个含 2 mL DMEM 培养基的培养皿中。为获取关节内滑膜组织，可在体视镜下沿骨两侧打开膝关节腔(图1C 中箭头3所示翻转暴露关节腔，小心剥离关节内滑膜组织(图1D 所示)。

2.滑膜组织的消化及 SF的培养

2.1 将修剪后的滑膜组织转1 .4移至含0.5 mL滑膜组织专用消化液的 EP管中，剪碎成1mm3的块。

2.2将 EP 管中平放置于 37℃摇箱中(200次/min)，振荡消化60min;置于涡轮机上高速振荡15 min 以保证细胞分离;

2.3 300Xg 离心5 min，吸弃上清

2.4 在超净台上加入滑膜成纤维细胞专用培养基常规培养，选用 T75培养瓶

小鼠滑膜成纤维细胞鉴定

1. 形态学鉴定

滑膜成纤维细胞在第 2 天即可见贴壁，3 d 后可进行第1次换液，以后每3-4 天换液1次，约在1周时即可进行第 1次传代。1 d 时滑膜巨噬细胞数量最多，此后随传代次数增多而减少，至第 3 次传代(第15-20 天)时滑膜巨噬细胞基本消失。

2. 标志物检测

用 Vimentin、CD90.2、CD54 和CD106 4 种细胞表面标志物对 SF的纯度进行分析。用 Vimentin 可以很好地进行 SF的免疫荧光细胞化学染色，显示其细胞纯度大于95%。流式细胞分析的结果显示，Vimentin和 CD90.2标识的细胞纯度超过95%，而 CD54 标识的细胞纯度约为80%，但CD106 标识的细胞纯度仅为 23%。