小鼠肝实质细胞分离培养步骤

小鼠肝实质细胞简介

肝实质细胞(hepatocytes)是肝脏的主要组成和功能细胞。原代肝实质细胞在肝脏疾病的体外模拟、肝病药物筛选、新药安全性评估等领域都有不可替代的应用，并在肝细胞移植治疗、体外生物人工肝等领域都有众多潜在的应用价值。但长期以来，原代肝实质细胞都无法体外长期培养，更无法体外扩增，一直是肝脏研究领域的关键障碍。

小鼠肝实质细胞分离培养步骤

小鼠肝实质细胞分离培养主要试剂

戊巴比妥、小鼠肝细胞灌注液1 (Perfusion buffer 1) 预热、小鼠肝细胞灌注液11 (Perfusion buffer 11) 预热、小鼠肝实质细胞完全培养基、留置针、镊子及剪刀、注射器、70um细胞筛、预冷离心机、水浴锅、促贴壁培养基 预冷

小鼠肝实质细胞操作步骤

1. 迅速麻醉小鼠，固定小鼠，75%酒精清理腹部

2. 腹部皮肉分离后剪开肌肉层至胸膈膜，并将内脏小肠等拨至自己右前方，充分暴露门静脉和下腔，在我们对应的左侧皮肤剪开口子用于引流灌流消化液体。

3. 在下腔静脉处入针，拔出导针有回血后用手固定

4. 灌流灌注液1 (Perfusion buffer 1)，缓慢灌入，可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，1-2min内推完10 mL至肝脏内无血液

5. 换上肝细胞灌注液11 (Perfusion buffer 11)，低速灌流，并节律性挤压门静脉切口(挤压5-10s左右，间隔30s-1min,让肝脏充盈，提高消化率)，持续消化5-10min不等，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹

6. 将肝小叶向上拨开，找到门静脉连接的肝门，用弯镊钳住，向前拉，剥离肝脏和膈膜连接后向上提，分离肝脏和内脏组织连接

7. 置入含有10mL预冷培养基的培养皿，转入超净工作台，随后用镊子撕裂肝包膜(直接撕裂肝小叶更迅速直接)，消化得当，撕裂后即有细胞掉落，液体变浑浊，用镊子夹住肝门晃落细胞或者用1mL枪轻轻吹打。

8. 用70um过滤器过滤到含10mL预冷促贴壁培养基的50mL离心管，此后操作注意保持低温，可提高肝细胞活性。

9. 50g，4℃，1min(第一次离心可设置2min，在1min后按stop)后吸走上清

10. 10mL~20mL(一只小鼠差不多10mL足够)预冷促贴壁培养基重悬后，计数和细胞活率，铺板

11. 12h后可换无血清培养基培养24-48h，一般会直接用于实验

6cm培养皿细胞量2x106cells

10cm培养皿细胞量5-6x106cells

小鼠肝实质细胞鉴定

1.形态学鉴定

倒置显微镜下观察肝细胞，刚分离的肝实质细胞呈分散状态，圆球形，细胞体透亮、细胞核清晰;接种后 6 h，部分肝实质细胞开始贴壁，细胞形状呈现不规则状，有向外延伸趋势，相邻的细胞间开始建立连接;培养 72 h，肝实质细胞呈不规则多角形，相邻肝细胞彼此连

接更加紧密，形成索状或岛状结构

2. 标志物检测

角蛋白 18(CK18)是正常肝实质细胞中高特异性表面抗原，可用来鉴定肝细胞。