小鼠成骨细胞分离,培养及鉴定方法

小鼠成骨细胞背景介绍

小鼠成骨细胞分离自颅骨组织;颅骨位于脊柱上方，由23块形状和大小不同的扁骨和不规则骨组成。除下颌骨及舌骨外，其余各骨彼此借缝或软骨牢固连结，起着保护和支持脑、感觉器官以及消化器和呼吸器的起始部分的作用。颅分脑颅和面颅两部分。脑颅位于颅的后上部，内有颅腔，容纳脑，共8块。面颅为颅的前下部分，包含眶、鼻腔、口腔等结构，构成面部的支架，共15块。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝;其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨;破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞培养不仅有助于了解骨形成机制、骨骼系统疾病的分子和细胞学基础，也是药物筛选、生物材料开发和生物工程研究的重要手段。

小鼠成骨细胞分离,培养及鉴定方法

试剂及工具

成骨细胞组织消化液1、成骨细胞组织消化液2、成骨细胞专用培养基、PBS磷酸缓冲液、双抗(100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml 链霉素)、两性霉素b、6 cm、手术剪，尖头镊，显微剪等解剖工具

小鼠成骨细胞分离培养操作步骤

1.取出生(2-3天)小鼠3-5只，将其放入一个大培养皿中，并用70%乙醇消毒。

2.用大剪刀取下头部，抓住颈背处的头部，沿着颅底做一个小切口。使用镊子小心地从头骨上去除皮肤和脑组织。

4. 切掉下颌，刮掉颅骨边缘周围的任何多余的组织和软骨。

5. 将颅骨切成两半，放入6cm培养皿中; 用PBS清洗颅骨。

6. 对第二只动物重复步骤 2-5。

7.将头盖骨在成骨细胞组织消化液2(1mL/颅骨)中，37°C孵育消化10分钟。消化结束后弃去胰蛋白酶溶液; 在成骨细胞专用培养基中洗涤。

8. 弃完全培养基，加入成骨细胞组织消化液2(800μl/颅骨)，在37°C孵育30分钟。(每10min吹打

9. 弃去消化液溶液，换成新鲜的成骨细胞组织消化液2，在37°C下继续消化60分钟。

10. 保留最终消化物并转移到15mL离心管中。加入5 mL成骨细胞专用培养基。

11.在室温下以1500×g离心5分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于成骨细胞专用培养基(1ml /颅骨)中。合并细胞悬液。

12.将20 mL 成骨细胞专用培养基加入T75培养瓶，往培养瓶中加入1mL胞悬液。

13. 将培养瓶在 37°C/ 5% CO2 培养箱培养，直到细胞达到汇合，大约三天左右

小鼠成骨细胞鉴定

1.形态观察

小鼠成骨细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形细胞，酶消化分离所得细胞接种于培养瓶， 24 h后细胞充分伸展，呈梭形、三角形或不规则多边形。

2. 染色鉴定

2.1碱性磷酸酶染色

第3代成骨细胞碱性磷酸酶染色，成骨细胞胞膜及胞浆内颗粒染色呈棕色或者咖啡色颗粒。

2.2茜素红染色结果

第 3 代成骨细胞培养 21 d 后，可以发现细胞汇合处呈现多层重叠生长，形成钙结节的不透明区域，茜素红染色后，钙结节被染成橘红色。