大鼠软骨细胞分离培养及鉴定方法视频教程

大鼠软骨细胞简介

大鼠关节软骨细胞分离自关节软骨组织;关节软骨属于透明软骨，表面光滑、呈淡蓝色、有光泽，它是由一种特殊的叫做致密结缔组织的胶原纤维构成的基本框架，这种框架呈半环形，类似拱形球门，其底端紧紧附着在下面的骨质上，上端朝向关节面，这种结构使关节软骨紧紧与骨结合起来而不会掉下来，同时当受到压力时候，还可以有少许的变形，起到缓冲压力的作用。在这些纤维之间，散在分布着软骨细胞，软骨细胞由浅层向深层逐渐由扁平样至椭圆或圆形的细胞组成，这些软骨细胞维持关节软骨的正常代谢。

关节软骨没有神经支配，也没有血管，其营养成分必须从关节液中取得，而其代谢废物也必须排至关节液中，关节软骨的这种营养代谢必须通过关节运动，使关节软骨不断的受到压力刺激才行，所以关节运动对于维持关节软骨的正常结构起重要的作用。关节软骨细胞位于关节软骨陷窝内。幼稚的关节软骨细胞位于关节软骨组织的表层，单个分布、体积较小、呈椭圆形，长轴与关节软骨表面平行，越向深层的关节软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形、染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。

成熟的关节软骨细胞多2-8个成群分布于关节软骨陷窝内，这些关节软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，关节软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，关节软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。体外培养的关节软骨细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

大鼠软骨细胞分离培养及鉴定方法

大鼠关节软骨细胞分离培养主要试剂

PBS磷酸缓冲液、软骨细胞组织消化液I、软骨细胞组织消化液II、大鼠软骨细胞专用培养基、双抗溶液、40μM细胞筛、培养皿、巴氏管、解剖工具等

大鼠软骨细胞分离培养及鉴定方法

大鼠关节软骨分离培养步骤

D1

1.把新生鼠(5-6D)以腹面朝下的姿势固定上，用针固定前腿。用剪刀和钳子去除后腿上的皮肤和软组织，使股骨脱位并丢弃软组织；

2.使用手术刀将股骨头、股骨髁和胫骨分离(图2b)，并放置在PBS中。

关节软骨看起来像一个规则的半透明小球体，而骨骼看起来是棕色的。

3.PBS冲洗两次

4. 将软骨片于10 mL组织消化液I中，在37℃培养箱消化45 min。

5. 吸出软骨将其放入一个新的培养皿中。加入新鲜的10 mL组织消化液I中，在37℃培养箱消化45 min。

6. 用移液管搅拌组织碎片以分离软组织。提取软骨碎片，并将其放入一个新的培养皿中，加入10 mL消化液II，4 ℃，过夜消化。

D2

1.将10 mL含有残留软骨的消化液II放入一个15 mL的试管中。将溶液依次通过25、10、5、2毫升的巴斯德移液管，以分散任何细胞聚集物。这就产生了分离细胞的悬浮液。

3.将细胞悬液通过40μM细胞筛，然后室温400g离心10 min，弃上清。

4.用5 mL PBS清洗并离心，然后用15 mL完全培养基重悬沉淀。

5.用血细胞计数仪计数软骨细胞。为了检测提取细胞的活力，进行台盼蓝染色，平均每只大鼠获得106个软骨细胞。

6.在培养皿上以8x103/cm2细胞的密度种板软骨细胞。置于37℃，5%CO2培养箱。

A. iMACs的培养(6-7D)

iMACs在第6-7天达到融合。培养2d后更换添加FCS的培养基。在第2、3、5、6d时，细胞状态图如图2e-h所示。

大鼠肋软骨的分离

D1

1.将大鼠置于固定台，腹面朝上，用针固定前后腿。将皮肤从肚脐切开到胸骨，然后用剪刀和钳子沿着肋骨切开(图3a)。

2.切开横膈肌，并清除胸腔内的所有软组织(即肺和心脏)(图3b)。

3.用剪刀取出肋骨(图3c)。放置于PBS中。用手术刀去除皮肤和软组织。(图3d)。

钙化肋骨看起来呈棕色(图3d)。

4.用PBS冲洗两次。

5. 将肋软骨片置于15 mL消化液I中，在37℃培养箱消化45 min。

6. 用移液管搅拌组织碎片以分离软组织。提取软骨碎片，并将其放入一个新的培养皿中，加入10 mL组织消化液II，在4℃，过夜消化。

D2

1.向500 mL培养基中加入50 ml FCS。

2.将15 mL含有残留软骨的组织消化液II放入一个15 mL的试管中。将溶液依次通过25、10、5、2毫升的巴斯德移液管，以分散任何细胞聚集物。这就产生了分离细胞的悬浮液(图2d)。

3.将细胞悬液通过40μM细胞筛，然后室温400g离心10 min，弃上清。

4.用10 mL PBS清洗并离心，然后用40 mL添加FCS的培养基重悬沉淀。

5.用血细胞计数仪计数软骨细胞。为了检测提取细胞的活力，进行台盼蓝染色，平均每只大鼠获得106个软骨细胞。

6.在培养皿上以25x103/cm2细胞的密度种板软骨细胞。置于37℃，5%CO2培养箱。。

未成熟大鼠肋软骨细胞在第6-7天达到融合。培养2d后更换添加FCS的培养基。在第6h、1、2、5d细胞状态图如图3e-h所示。

大鼠软骨细胞鉴定

1. 形态观察

使用显微镜观察软骨细胞的形态。汇合的iMAC表现出典型的软骨细胞形态，圆形或多边形，细胞质呈颗粒状

2. 标志物鉴定

检测iMACs原代培养中软骨细胞分化的主要标志物，II型胶原和蛋白聚糖的表达；

体外培养6d后的合成富含II型胶原蛋白和蛋白多糖的基质，对II型胶原蛋白进行免疫荧光检测，阿尔新蓝染色确定ECM中存在蛋白多糖的基质(硫酸化蛋白聚糖)