人皮肤成纤维细胞分离,鉴定及传代方法视频教程

人皮肤成纤维细胞背景简介

人真皮成纤维细胞分离自皮肤组织内的真皮层;皮肤组织来源包括头部、脸部、手、脚、腿、背部、腹部、包皮等体表部位皮肤，可依据需求选用;真皮，位于表皮深层，向下与皮下组织相连，真皮结缔组织的胶原纤维和弹性纤维互相交织在一起，埋于基质内。其内分布着各种结缔组织细胞和大量的胶原纤维弹性纤维，使皮肤既有弹性，又有韧性。其由两层组成——乳头层与网状层。

真皮的结构组成是胶原蛋白、弹性纤维以及基质。成纤维细胞(Fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化;成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。

人皮肤成纤维细胞分离,鉴定及传代方法

人皮肤成纤维细胞分离培养所需试剂及器械

皮肤成纤维细胞专用培养基，10cm培养皿，六孔板，T175培养瓶，手术刀，手术镊子及相关解剖器械，HSF组织消化液，胎牛血清，双抗，庆大霉素

人皮肤成纤维细胞分离操作流程

酶消化

1. 获取要求组织宽度大于3mm。在手术室中将组织置于预冷至4℃、含0.5%双抗的无菌PBS缓冲液中，保证组织完全浸没

2. 用含0.5%双抗的PBS缓冲液反复冲洗组织块10~15遍，直至组织块表面无肉眼可见的污物。

3. 再次用含0.5%双抗的PBS缓冲液冲洗处理后的组织块，并用眼科剪剪成约5mm×5mm的小块，完全浸入HSF组织消化液I中，将1.5 mL离心管用锡纸包裹紧密以避光，置于4℃冰箱中消化18~20h。

4. 次日，采用酶消化法处理组织块。将1.5 mL EP管取出，于超净台中打开，用含0.5%双抗的PBS缓冲液反复冲洗。撕下真皮层.

5. 置于加入了HSF组织消化液II的培养皿中，用眼科剪轻柔地将上皮尽量剪碎，防止破坏培养皿底部导致污染。完全剪碎后，将培养皿盖好并用封口膜封住，置于细胞培养箱中消化15 min，每隔5 min取出至超净台中反复吹打混匀。

6. 15 min后，加入1mL胎牛血清终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000r/min离心5min，吸去上清

7. 用5ml人皮肤成纤维专用培养基重悬，转移至T25细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2条件下培养

人皮肤成纤维细胞鉴定观察

1. 形态观察

成纤维细胞刚接种的细胞也呈球形，贴壁后，胞体呈梭形或三角形，有2-3个长短不一的突起，胞核椭圆形，位于胞体中间，无异常核分裂相;细胞汇合后，排列紧密，呈典型漩涡状、放射状走行。成纤维细胞具有细长的纺锤状细胞体的特征形态特征，圆形至椭圆形细胞核，并且成纤维细胞在汇合时成对生长并成束生长。培养基支持成纤维细胞的生长，而其他细胞群(例如角质形成细胞)需要额外的补充剂和生长因子，或者在有丝分裂上活性较低，这允许相对纯的成纤维细胞培养。

刚分离的真皮成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团;细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状;细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。真皮成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持组织的正常形态，合成和释放细胞外基质以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。

2. 标志物检测

维细胞抗SERPINH1(也称为HSP-47)，它是位于内质网中的胶原特异性分子伴侣。HSP47在皮肤成纤维细胞的胶原蛋白生物合成中起着至关重要的作用。