人外周血CD8+T细胞分离,培养步骤

人外周血CD8+T细胞背景介绍

CD8+T-αβ细胞发育始于胸腺的淋巴祖细胞，在胸腺细胞变成单阳性(SP)CD8+或CD4+胸腺细胞(图2)[2]之前，淋巴祖细胞先后经历双阴性(DN)(CD8– CD4–)阶段和双阳性(DP)阶段(CD8+ CD4+)。关于CD8+T细胞如何形成特异性，DP细胞通过与肽：MHC I类复合物的相互作用在胸腺皮质中进行阳性选择，生成CD8+SP细胞。随后这些SP细胞从皮质迁移到髓质，然后将在髓质中进行阴性克隆选择，以去除与自身抗原高亲和力结合的T细胞。最后，成熟单阳性CD8+T-αβ细胞被释放到循环中。

人外周血CD8+T细胞分离,培养步骤

人外周血CD8+T细胞分离培养主要试剂

人外周血淋巴细胞分离液，人外周血淋巴细胞清洗液，rhIL-2，IFN-γ，581培养基，CD8+T分选磁珠，MS分选柱，Multi Stand磁力架

人外周血CD8+T细胞分离,培养操作过程

1.细胞分离

(1) 抽取健康供者外周血10 mL，将血标本缓慢加入两个盛有5 mL外周血淋巴细胞分离液的15 mL无菌离心管中，保持界面清晰。

(2) 400g，30-40 min。

(3) 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴 细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

(4) 取白环层，加入 3 倍体积的清洗液混匀，60-100 g，离心 10 min，

(5) 弃上清。加 6-8 mL 清洗液混匀，60-100 g，离心10 min，弃去上清后以0.2 mL培养基重悬细胞后移入0.5 mL EP管。

(6) 取20 μL CD8+T细胞分选磁珠，加入细胞悬液，混匀。4℃孵育20 min，每5 min轻轻弹一次。

(7) 过MS分选柱: 将MS柱放入Vario MACS分选系统的磁场;加500 μL buffer冲洗MS柱;待buffer完全过柱后，加入细胞悬液，收集流出液——未标记细胞;待细胞完全过柱后，加buffer洗MS柱(3×1 mL)，最后用配套的活塞推出CD8+T细胞于0.5 mL EP管中。

人外周血CD8+T细胞扩增培养步骤

加入CD8+T细胞完全培养基，CD3/CD28磁珠，将CD8+T细胞移入T25培养瓶，密度为5x105/mL。当细胞密度超过1x106后进行等量补液。培养体积扩大后依次转入T75和T175进行扩增。