人口腔黏膜上皮细胞分离培养方法

原代人口腔黏膜上皮细胞背景简介

人表皮角质形成细胞分离自皮肤组织;表皮位于动物皮肤的外层，由胚胎时期外胚层形成，具有抗摩擦和抗损伤的作用。表皮是皮肤的浅层结构，由复层扁平上皮构成。从基底层到表面可分为五层，即基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。表皮角质形成细胞是一种能合成角质蛋白的上皮细胞，此类细胞为表皮的主体，由表皮深层始逐渐增殖、分化，并在成为角化的角质细胞中，细胞核与细胞器完全消失，细胞亦失去生理功能而脱落。未脱落部分对机体尚有保护作用，故不必在洗擦身体时用力搓擦，使其过早脱失。表皮角质形成细胞主要分布于表皮基底层，在上皮程序性死亡后，细胞产生角化并移向表皮。体外培养的表皮角化细胞容易导致终末分化，不能充分增殖。角质形成细胞最终产生角质蛋白，在其向角质细胞演变过程中，一般可以分为四层，即基底层、棘层、颗粒层以及角质层。有人把前三层或前二层称为生发层或马尔匹基层。此外，在某些部位，特别在掌跖部位，角质层下方还可见到透明层。

皮肤不但是人体的生理屏障，而且在机体免疫和内分泌等方面起着极其重要的作用。 角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，角质形成细胞的体外培养可为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病机制的研究提供新的途径。 但是，皮肤角质形成细胞分离培养中存在细胞易分化、易受成纤维细胞污染、不易贴壁等问题，因此，建立一种操作简便、细胞活性优良的人角质形成细胞分离培养方法具有重要的意义。

人口腔黏膜上皮细胞分离培养方法

人口腔黏膜上皮细胞分离培养主要试剂与仪器

角质细胞专用培养基，角质细胞组织消化液I，角质细胞组织消化液II，胎牛血清，DMSO，双抗，庆大霉素，T25细胞培养瓶，细胞培养箱，超净工作台，低速离心机，手术刀片，尖头镊等

人口腔黏膜上皮细胞分离培养操作过程

1. 获取要求组织宽度大于3mm。在手术室中将组织置于预冷至4℃、含0.5%双抗的无菌PBS缓冲液中，保证组织完全浸没

2. 用含0.5%双抗的PBS缓冲液反复冲洗组织块10~15遍直至组织块表面无肉眼可见的污物。用眼科剪仔细剪净组织块的黏膜下组织，只留黏膜层，要求尽量平整，不剪碎、剪破组织块

3. 再次用含0.5%双抗的PBS缓冲液冲洗处理后的组织块，并用眼科剪剪成约5mm×5mm的小块，完全浸入角质细胞组织消化液I的中，将1.5ml离心管用锡纸包裹紧密以避光，置于4℃冰箱中消化18~20h。

酶消化法

1. 次日，采用酶消化法处理组织块。将1.5ml EP管取出，于超净台中打开，用含0.5%双抗的PBS缓冲液反复冲洗。可观察到皮肤上皮层呈现淡黄色，用眼科镊轻轻撕下上皮层，反复冲洗至清亮透明

2. 置于加入了角质细胞组织消化液II的培养皿中，用眼科剪轻柔地将上皮尽量剪碎，防止破坏培养皿底部导致污染。完全剪碎后，将培养皿盖好并用封口膜封住，置于细胞培养箱中消化15min，每隔5min取出至超净台中反复吹打混匀。

3. 15min后，加入1ml胎牛血清终止消化，将细胞悬液转移至15ml离心管中，1000r/min离心5min

4. 吸出上清液并将细胞沉淀轻轻重悬于1 ml角质细胞专用培养基中，计数

5. 以 5 x 104 /cm2的密度接种预先包被明胶的培养皿中，在37℃、5%CO2条件下培养

6. 初始接种后24小时更换培养基以去除未附着的细胞，并每天更换培养基，直到细胞达到所需的汇合度。

人口腔黏膜上皮细胞鉴定

1.形态学鉴定

角质形成细胞刚接种时呈球形，折光性强，轮廓清晰，24h可见部分细胞贴壁并形成集落，贴壁细胞呈多角形，胞浆透亮，胞核较大，内含1-2个核仁。5d后集落周围出现淡色卫星样细胞增殖，胞浆丰富，均匀透亮;细胞长满单层后，呈现典型的铺路石状，细胞呈多角形，细胞之间出现“拉网”现象。10d后细胞大部融合成片。

2.标志物检测

Cytokeratin-18(CK18)是基底层角质形成细胞的阳性标记物。镜下可见培养细胞cK18免疫荧光染色显示为阳性，证实培养细胞为基底层角质形成细胞。