人外周血NK细胞分离培养视频教程

NK细胞介绍

NK细胞(natural killer cell, NK)通常被称作自然杀伤细胞，无须抗原预先致敏即可直接杀伤某些靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞。

NK细胞是机体重要的天然免疫细胞之一，主要存在于脾脏和外周血中。当感染首次发生时，NK细胞能主动出击，杀死被感染的细胞，因此也被称为“天然杀手”。

人外周血NK细胞分离培养

本实验室采用独有的细胞因子培养法，将外周血中的单个核细胞进行诱导，经过14天的诱导培养，CD3-/CD56+NK细胞绝对数量可扩增达到1000倍，其纯度可达80%以上。

优势

1.无需预包被，操作简单；

2.扩增效率高；

3.目的细胞百分比高的特点。

实验前准备

(1)提前开启紫外线照射超净台30min。

(2)紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10min以上。

(3)水浴锅提前开启，加热至56摄氏度;

(4)KBM-581培养基、IL-2提前从冰箱取出，放至室温。

试剂耗材

试剂：人PBMC细胞分离液、清洗液、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、581培养基(图片)

耗材：10ml移液管，15ml离心管，采血管，T75培养瓶(图片)

仪器;离心机、CO2培养箱、冰箱、显微镜(图片)

人外周血NK细胞实验步骤

(一)单个核细胞分离

血液样本量10mL 时， 实验方法如下：

第一步：铺血

1. 取2支 15mL 离心管， 各加入 5mL 分离液(与血液体积相同)。

2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上;

第二步：离心

3.500xg，离心 20min。(分离PBMC时离心转速设置为慢升慢降，升为9，降调为0;)

4. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。(分层图片)

第三步：血浆灭活

5. 收集血浆到新的离心管中;血浆56摄氏度30min灭活，900xg离心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次900xg离心10min，取上清，置于4℃保存。

第四步：分离单个核细胞

6. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一50mL离心管中，向所得离心管中加入10mL 清洗液，混匀细胞。

第五步：清洗

7 . 300xg，离心 10min。

8 . 弃上清。

9. 用吸管以 10mL 清洗液重悬所得细胞。

10. 300xg，离心 10min。

11. 重复 7、 8、 9，弃上清后以 0.5mL (根据实验需要重悬体积不等)后续实验所需相应液体重悬细胞。

(二)NK细胞培养

1. D0 ：将制备好的单个核细胞(PBMC)重悬，按细胞密度1.0-2.0M cells/mL铺于T-25瓶中。约用10ml 581培养基，培养基加入因子IL-2 (1000 U/mL)、IL-12(20 ng/mL)、IL-15 (20 ng/mL)、IL-18(100ng/mL)和5%自体血浆。

2. D4 ：补加10ml培养基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自体血浆)，此时瓶子含20mL培养基。

3. D6： 补加20ml培养基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自体血浆)，此时瓶里含有40ml培养基。

4. D8 ：往培养瓶补加40ml培养基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自体血浆)，同时加入IL-21(50 ng/mL)，此时瓶子含80mL 培养液。

5. D10：往培养瓶补加80ml培养基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自体血浆)，此时瓶子含160mL 培养液。

6. D12：往培养瓶补加160ml培养基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自体血浆)，此时瓶子含320mL 培养液。

7. D14-15 ：收获目的细胞。

注意事项：请勿吹打细胞，细胞维持抱团生长，如果聚团过大，可轻揉或者拍打培养袋。如果想得到更理想的扩增效果，可使用CD56抗体预包被瓶子。

流式鉴定细胞纯度达80%以上