第六节:iPSCs诱导拟胚体实验视频教程

iPSCs诱导拟胚体实验介绍

拟胚体(EB)的形成实验是胚胎及多能干细胞分化的主要步骤。在细胞脱离E8培养体系后，多能干细胞经 EB 形成培养基的刺激会自发分化形成三维聚集体，这种结构有利于细胞的相互作用，比如细胞间的接触和间隙连接的建立。

本方法基于Andrew Elefanty博士发表的APEL配方添加相关因子的非传统多能干细胞贴壁诱导EB法。收集高质量的iPSCs或者ESC细胞低密度接种于包埋了基质胶或者VNT的12孔板中贴壁克隆2天后，停止换液消耗培养基中抑制细胞分化的因子，添加启动分化的化合物，让克隆团悬浮分化，平均在4-5天内形成大小，分化程度均一的悬浮拟胚体，添加相应因子或化合物具有三胚层细胞谱系分化的潜能。

iPSCs诱导拟胚体实验视频教程

DO-阶段1：iPSCs的培养(以IMMOCELL hiPSCs 为例)

1.取状态良好，汇合度75-80%的hiPSCs细胞经常温的DPBS洗涤1-2次后，用immocell hPSC 温和消化液+Y 消化7-8分钟后，用1mlhPSC完全培养基终止消化，收集于1.5ml离心管中。

2.取10ul细胞悬液加入台盼蓝，测试细胞活力和数量，汇合度在8成的6孔板消化后细胞密度平均为100000，加入1ml完培稀释到50000个细胞左右。部分细胞系的iPSCs克隆密度较小，可适当降低稀释比例。

3.准备用Stem&Easy 即用铺板液铺板的常规12孔板(铺板后需在4度过夜),每孔加入1ml的Stem&induce EB BasalMedium+补充液，常温放置。

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4.将2ml的细胞悬液按每孔100ul的体积加入铺好胶的12孔板中。2ml悬液可以满足2个12孔板的EB诱导，至少形成120-300个悬浮成熟的囊状EB。

D1-阶段2：在 EB培养基中形成岛状iPSCs细胞克隆

1、将上述接种好的细胞十字摇匀后，置于常规培养箱中，部分实验需求可置于低氧培养箱中培养。

2、阶段2一共需要2天，每天都需要更换培养基，(1)是为了扩大单克隆的面积，(2)是为了将悬浮的单细胞去除净化培养体系。

注意阶段2中不要将细胞长时间的在室温下观察，过度摇晃，喷洒刺激性消毒液体如乙醇等。更换的培养基需要常温预温到RT。

D3到D4 阶段3到4: iPSCs的悬浮

1.第三天开始克隆团面积均一，边缘变的明亮，说明即将悬浮形成EB，D3到D4都无需换液，仅仅只需加入Stem&Easy活性保持液10ul摇匀即可。

2.第四天部分克隆团开始悬浮，但因为克隆团差异部分EB可能还未发育成熟形成囊状EB，视实验需求补充EB完全培养基，平且每2小时用大口p1000枪头吹打1-3次活置于孵化摇床上，降低EB的相互粘连。

成熟的囊状EB具有三胚层谱系细胞标志maker，在加入特定生长因子的情况下可以启动特殊EB的分化程序。

D5后 阶段4 EB的分化启动(以中胚层及肾祖细胞特化为例)

1、在EB BasalMedium的基础上添加FGF9加Heparin及GSK3-β抑制剂(具体比例可了解immocell Organoids&induce系列的肾类器官培养试剂盒或技术定制服务。

2、用宽口p1000移液器吸取EB和全部培养基，常温自然沉降EB后，吸取上清，添加以上体系。在EB BasalMedium的基础上添加FGF9加Heparin及GSK3-β抑制剂，诱导天数2-3天，无需换液。

3、用GSK3-β抑制剂激活1小时后实验双成基质胶包埋法、小室培养法或悬浮培养法补充肾类器官诱导及成熟培养基，获得成熟的肾类器官。

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