第五节:hPSC定向诱导三胚层实验(单层法)视频教程

hPSC定向诱导三胚层实验(单层法)视频教程

背景介绍

干细胞作为一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，是医学研究上用来研究组织和器官再生、药物筛选，调控细胞命运转换以及动物发育分子机制的良好模型。从2007年，3位科学家以“利用胚胎干细胞把特定基因改性引入实验鼠的原理”获得“诺贝尔生理学或医学奖”，到2012年日本山中伸弥博士因“发现成熟细胞可以被重新编程诱导成为多能干细胞及戈登爵士的克隆生物学发现”再次斩获“诺贝尔生理学或医学奖”无一不证明了“20世纪是药物治疗的时代，21世纪是细胞治疗的时代”。

基于hPSC的多能干性，体外环境下，hPSC可以在多种细胞因子或小分子药物的相互作用下，可分化形成内、中、外3个胚层。进而可以体外模拟人胚发育，构建模拟标准化的人体细胞、组织和器官。同时非先启动及特异性分化的胚层诱导也是验证hPSC分化能力的重要实验方法。

实验介绍

Tri-embryonic differentiation kit三胚层分化试剂盒提供了一种简单的诱导方案，可使人胚胎干(ES)和诱导的多能干(iPS)细胞向三个胚层分化的能力 神经性外胚层，中胚层和内胚层。该试剂盒包括专门的单一体系培养基和基于单层诱导(无需形成EB)的方案，对每个胚层进行平行的体外定向分化实验，在一周内清楚地、可重复地建立三系分化潜力。

准备工作

Stem&Easy 即用铺板液铺板12孔板、准备好冷藏的Stem&Easy Planking solution，吸取6ml铺板液，每孔加入500ul，十字摇匀后4度过夜冷藏或者常温放置2小时后使用。

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Stem&Easy系列：Planking Solution 32ml

阶段1：hPSCs的培养及内胚层的直接诱导-以IMMOCELL -ESC(H9)细胞系为例

1、取状态良好，汇合度75-80%的ESC经 常温的DPBS洗涤1-2次后，用immocell hPSC 温和消化液+RI 消化7-8分钟后，用1ml hPSC完全培养基终止消化，收集于1.5ml离心管中。

2、取10ul细胞悬液加入台盼蓝，(不用观测)测试细胞活力和数量，汇合度在8成的单个6孔板消化后细胞密度平均为100000，分别加入10ml DE d 抑制剂和20ml hPSC完全培养基+ROCK抑制剂稀释到100000和50000个细胞左右。

3、准备3个用Stem&Easy 即用铺板液铺板的常规12孔板(铺板后需在4度过夜),在不破坏基质的情况下小心吸取5-10孔的上清，尽管体系的不同细胞密度，但是每孔依旧加入2ml细胞悬液。

总的来说，内胚层直接诱导的12孔板中有5孔诱导体系，而20ml稀释的悬液体系有10孔，用于中、外胚层的诱导。

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阶段2：中胚层诱导及中、内观察

1、将上述接种好的细胞十字摇匀后，置于常规细胞培养箱。其中内胚层为优化的直接诱导体系，从接种到成熟只要4天，成熟的内胚层谱系细胞排列及其紧密。(如下)

2、中、外胚层的诱导体系和hPSC的E8培养体系差异过大，直接诱导细胞容易出现应激而不贴壁，中胚层建议贴壁1D后开始诱导。

3、观察未加诱导液细胞的生长状态和克隆密度，贴壁1天后细胞克隆密度达到30%,可以进行中胚层诱导。吸取上清的hPSC完胚后，用减血清DMEM/F12洗涤一遍后每孔加入1ml的MD differentiation Medium+ROCK抑制剂，中胚层诱导过程会有大量细胞漂浮，为正常现象，约5天后中胚层细胞谱系达到70%的汇合率，细胞形态类似间充质细胞，呈现纤维状。(如下)

阶段3:神经外胚层诱导

1、外胚层由神经外胚层、神经嵴(neural crest, NC)、颅基板(cranial placode, CP)和非神经外胚层四种主要的外胚层谱系所组成，每个外胚层谱系诱导方案不同，本方案主要诱导NC外胚层。

2、在hPSC贴壁2天后细胞克隆密度达到60-70%,吸取上清的hPSC培养基，用减血清DMEM/F12洗涤一次后每孔加入2ml的NeuroED differentiation Medium+ROCK抑制剂及10ul的NC 补充液A和10ul的NC补充液B诱导2天向1阶段外胚层谱系诱导。

3、1阶段诱导结束后吸弃上清加入2ml的NeuroED differentiation Medium和8ul的NC补充液A,诱导6-12天，每两天换液一次，6天后外胚层谱系细胞状态呈现神经元细胞状，且每天都有许多细胞漂浮，为正常现象，按时换液即可。

系列/方案iPSCs细胞扩增三胚层诱导其他试剂

诱导结果的q-PCR分析