小鼠心肌细胞分离/培养及鉴定实验方法教程

原代小鼠心肌细胞简介

心脏是发育中的胎儿中第一个形成的器官，在胎儿和出生后发育期间，心肌细胞成为终末分化的肌肉细胞，通过间隙连接首尾相连允许协同收缩活动。心肌细胞的收缩-松弛周期由肌膜去极化引发的，细胞内Ca2+的周期性增加和减少协调，并由肌质网的Ca2+释放和重亲摄理持。

原代小鼠心肌细胞提取实验工具

无菌镊子、无菌组织剪、细胞筛、锥形瓶、HBSS缓冲液、小鼠心肌细胞专用培养基、小鼠心肌细胞纯化培养基、心肌细胞组织专用消化液2、心肌细胞组织专用消化液1、0.1%明胶、三抗、溴脱氧尿苷、培养皿。

小鼠心肌细胞分离操作过程

1.小鼠心肌细胞分离(第一天)提前开启紫外线照射超净台30分钟HBSS缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上；

2.取出生(2-3天)小鼠3-5只使用异氟烷将乳鼠麻醉，喷酒精全身消毒用灭菌工具取出跳动的心脏并将心脏放入装有4 mL预冷HBSS(三抗1：100稀释使用，即100ml加1ml三抗)的6cm培养皿中注意尽快取出心脏，并迅速将它们放在冰上所有步骤都应在冰上进行；

3.取出心脏后多个心脏放入同一个培养皿旋转培养皿清洗心脏组织清洗后转入新的装有4 mL预冷HBSS的培养皿中继续清洗取心室，大约心尖往上2/3处将组织转入装有HBSS的培养皿清洗完成以上步骤转入新的培养皿，置于冰上将组织块装入离心管中加入预冷的心肌细胞组织专用消化液1，重悬组织块使用手术剪将心脏剪成小于1mm3的组织块做好标记，放入4°C培养箱中过夜消化；

4.心肌细胞分离(第二天)提前开启紫外线照射超净台30分钟将培养基和添加剂室温融化使用前室温中预温10到30分钟75%酒精消毒超净台超净台通风10 分钟以上，用0.1%明胶包被培养皿，以6孔板为例每孔加入1mL明胶浴液置入37°C培养箱孵育两小时，吸弃明胶溶液再加入HBSS缓冲液清洗将过夜消化的组织消化液取出加入1mL酶抑制剂轻弹管壁重悬37°C培养箱孵育30分钟弃去上清，加入5mL心肌细胞组织专用消化液2转移至锥形瓶中，将其封口置于培养箱170-220转，搅拌45min充分研磨组织过70μM细胞筛加入5mL的培养基(不含血清)冲洗离心管过筛继续室温放置20-60分钟置于离心机1500转 离心5 min弃去上清加入20mL心肌细胞纯化培养(100ml培养基)基重悬将细胞悬液铺于两个10cm培养皿放入培养箱培养1小时预培养后，轻轻旋转培养皿并从两个10cm培养皿中收集含有上清液的心肌细胞。收集细胞悬液1500转 离心5 min。

将细胞重悬于心肌细胞纯化培养基(需要添加0.1mM BrdU)中，细胞悬液接种于明胶包被的六孔板中(2x105/孔)，24小时后换液，更换心肌细胞专用培养基(需要添加0.1mM BrdU)。继续培养24小时后，更换心肌细胞专用培养基(不用添加BrdU)。此后每两天更换传代培养基

小鼠心肌细胞形态观察

心肌组织消化后所有心肌细胞均为圆形，培养2到3小时部分细胞开始贴壁12h后可见梭形细胞，细胞逐渐增大部分贴壁的细胞出现自发性搏动24h细胞几乎全部贴壁，可见多角形细胞及较多细胞搏动48h细胞形态为多角形或梭形细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，铺满瓶底。

小鼠心肌细胞标志物检测

逸漠实验室分离的小鼠心肌细胞一般经免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。