第一节:小鼠神经小胶质细胞分离、培养、鉴定教程

细胞简介

神经小胶质细胞分离自脑组织;大脑分左右两个半球，大脑皮质(灰质)覆盖着每个大脑半球的大部分，它是神经元胞体集中的地方。内部则是由神经纤维或髓鞘构成的白质。每一个半球都有三个面，即外侧面(约占整个皮质面积的1/3)、内侧面和底面(占2/3的面积);半球表面有很多深浅不等的沟或裂，沟或裂之间的隆起叫回，它们大大增加了大脑的表面积；大脑外侧面重要的沟、裂有大脑外侧裂、顶枕裂和中央沟。由于三沟裂之界隔，使大脑皮质组分为额叶、顶叶、颞叶、枕叶四大部分。小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20%，小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病、多发性硬化和阿兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。它们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子(TNF)，一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质。神经小胶质细胞的主要功能：①神经胶质出现在大脑发育早期向成熟阶段转化的过程中;②当程序性细胞死亡时，或在大脑发育的过程中，中枢神经系统受损或受到病理损坏时，神经胶质可做为大脑的巨噬细胞;③胶质细胞能在Ⅱ类组织相容性复合体表达CD-4阳性T细胞时表达抗原，能进行Fc介导的巨噬作用，并且与造血细胞和巨噬细胞组织共享抗原。

细胞形态

小鼠神经小胶质细胞形态

细胞特点

①神经胶质出现在大脑发育早期向成熟阶段转化的过程中;当程序性细胞死亡时，或在大脑发育的过程中，中枢神经系统受损或受到病理损坏时，神经胶质可做为大脑的巨噬细胞;

②胶质细胞能在Ⅱ类组织相容性复合体表达CD-4阳性T细胞时表达抗原，能进行Fc介导的巨噬作用，并且与造血细胞和巨噬细胞组织共享抗原。

实验准备

1. 工具

小鼠神经小胶质细胞完全培养基 Microglia Basal Medium (MBM)(IMP-M120-1)、HBSS缓冲液、PBS磷酸缓冲液、10% FBS DMEM培养基、75%酒精、多聚赖氨酸、尖头镊、弯镊、剪刀、冰盘、10 厘米培养皿、6 厘米 培养皿

2. 提前开启紫外线照射超净台30分钟。将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 分钟。HBSS缓冲液缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上。

3. 包被培养皿：将10x的多聚赖氨酸稀释成1x的工作液，将培养瓶底部加满。过夜或两小时，结束后，使用PBS缓冲液洗2-3次备用。

操作步骤

1. 取3个10 厘米 培养皿，3个6 厘米 培养皿倒入HBSS缓冲液，置于冰盘上

2. 取出生2天内的新生鼠，泡入装有75%酒精的离心管内

3. 待小鼠死亡后，在1中漂洗2-3次

4. 取脑子：用尖头镊剥离鼠头部及脑壳，取出脑子，放入6 厘米培养皿

5. 剥脑膜：将一个脑移至一个新的6 厘米 培养皿(两三个脑子用一个6 厘米培养皿，防止太久HBSS缓冲液升温)，在解剖镜下去除嗅球，小脑及两个大脑半球中间的连接物，将剥干净的皮层放入新的6 厘米培养皿。

6. 将剥离好的皮层夹碎至浆糊状，组织使用10%FBS DMEM培养基稀释，准备铺入包被的培养瓶

T75培养瓶3个脑袋，大培养瓶 4-5个脑袋。

7. 培养三天后，更换神经小胶质细胞完全培养基，换液后一周左右长满，期间不用再换液。

细胞鉴定

1. 形态观察

小鼠神经小胶质细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形，细胞属于终末分化细胞;属于不增殖细胞群

2. 标志物鉴定

逸漠实验室分离的小鼠神经小胶质细胞经CD11b免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上

小鼠小胶质细胞标志物荧光鉴定