第二节:小鼠神经星形胶质细胞分离、培养、鉴定教程

细胞简介

小鼠神经星形胶质细胞分离自脑组织;大脑分左右两个半球，大脑皮质(灰质)覆盖着每个大脑半球的大部分，它是神经元胞体集中的地方。内部则是由神经纤维或髓鞘构成的白质。每一个半球都有三个面，即外侧面(约占整个皮质面积的1/3)、内侧面和底面(占2/3的面积);半球表面有很多深浅不等的沟或裂，沟或裂之间的隆起叫回，它们大大增加了大脑的表面积;大脑外侧面重要的沟、裂有大脑外侧裂、顶枕裂和中央沟。由于三沟裂之界隔，使大脑皮质组分为额叶、顶叶、颞叶、枕叶四大部分。神经星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术(银染色)显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。细胞突起的末端常膨大形成脚板或称终足，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上，因此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜。细胞刚分离时呈圆形，24 h后大部分细胞贴壁，均匀分布于瓶底，部分细胞伸出细小突起，培养4-5 d后细胞数量明显增多，呈扁平、多角形，胞质丰富且核浆较少，细胞核呈椭圆形，偏于胞体一侧。神经星形胶质细胞是中枢神经系统的重要细胞组成，不仅具有支持功能，还能够合成及分泌多种神经活性物质，在维持神经元内外环境、生存、迁移、免疫调节、信号转导、轴突生长及功能整合等方面具有重要作用。

实验准备

1. 工具

小鼠神经星形胶质细胞基础培养基Astrocyte basal Medium (ABM)、HBSS缓冲液、PBS磷酸缓冲液、75%酒精、多聚赖氨酸、尖头镊、弯镊、剪刀、冰盘、10 厘米培养皿、6 厘米培养皿

2. 提前开启紫外线照射超净台30分钟。将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 分钟。HBSS缓冲液缓冲液预冷，紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上。

3. 包被培养皿：将10x的多聚赖氨酸稀释成1x的工作液，将培养瓶底部加满。过夜或两小时，结束后，使用PBS缓冲液洗2-3次备用。

操作步骤

1. 取3个10 厘米 培养皿，3个6 厘米 培养皿倒入HBSS缓冲液,置于冰盘上

2. 取出生2天内的新生鼠，泡入装有75%酒精的离心管内

3. 待小鼠死亡后，在1中漂洗2-3次

4. 取脑子：用尖头镊剥离鼠头部及脑壳，取出脑子，放入6 厘米培养皿

5. 剥脑膜：将一个脑移至一个新的6 厘米 培养皿(两三个脑子用一个6 厘米培养皿，防止太久HBSS缓冲液升温)，在解剖镜下去除嗅球，小脑及两个大脑半球中间的连接物，将剥干净的皮层放入新的6 厘米培养皿。

6. 将剥离好的皮层夹碎至浆糊状，组织使用神经星形胶质细胞完全培养基稀释，准备铺入包被的培养瓶

T75培养瓶3个脑袋，大培养瓶 4-5个脑袋。

7. 每3-5天换液，一般12天左右长满，长满后开始传代，

细胞鉴定

1. 形态观察

小鼠神经星形胶质细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形，细胞可传5代左右;3代以内状态最佳。

2. 标志物鉴定

小鼠神经星形胶质细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。