Nature 重磅！Ostα/β 结构解析揭示胆汁酸转运新机制

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Structures of Ostα/β reveal a unique fold and bile acid transport mechanism

中文标题：Ostα/β 的结构揭示独特折叠模式与胆汁酸转运机制

发表期刊：《Nature》

影响因子：48.5

作者单位：

1.Research Center for Medicinal Structural Biology, National Research Center for Translational Medicine at Shanghai, State Key Laboratory of Medical Genomics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, China

2.Division of Gastroenterology and Hepatology, Key Laboratory of Gastroenterology and Hepatology, Ministry of Health, State Key Laboratory for Oncogenes and Related Genes, NHC Key Laboratory of Digestive Diseases, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai Institute of Digestive Disease, Shanghai, China

3.The State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China

University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

4.Institute of Aging and Tissue Regeneration, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, China

5.The Shanghai Advanced Electron Microscope Center, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China

作者信息：

Xuemei Yang、Nana Cui、Tianyu Li、Xinheng He(共同第一作者)、Heng Zhang、Canrong Wu、Yang Li、Xiong Ma*、H. Eric Xu*(* 为通讯作者)

研究背景

胆汁酸和类固醇激素稳态对人类健康至关重要，其紊乱与代谢性疾病和内分泌疾病密切相关。有机溶质转运体 Ostα/β 是肠肝循环中胆汁酸外流的关键分子，对维持胆汁酸稳态不可或缺，同时还参与类固醇结合物和外源性物质的转运，在内分泌信号传导和外源性物质代谢中发挥核心作用。Ostα/β 功能异常会导致胆汁淤积性肝病和代谢紊乱等严重疾病，但长期以来其分子机制尚未明确。与钠依赖的胆汁酸转运体 NTCP 和 ASBT 不同，Ostα/β 通过钠非依赖机制发挥作用，且其独特的异源二聚体结构(Ostα 含 7 个跨膜螺旋，Ostβ 含 1 个跨膜螺旋)缺乏与已知转运体的序列同源性，结构预测难度较大。近期生物信息学分析发现 Ostα 与 TMEM184 蛋白家族存在进化关联，为解析其结构和功能提供了线索。因此，研究人员通过冷冻电镜技术解析 Ostα/β 的 apo 态和底物结合态结构，旨在揭示其独特的转运机制，为相关疾病的治疗提供结构基础。

研究方法

构建人源 Ostα/β 异源二聚体表达系统，在 Expi293F 细胞中瞬时共表达 Ostα(C 端 Flag 标签)和 Ostβ(C 端 His 标签)，通过抗 Flag 亲和层析和尺寸排阻色谱纯化获得高纯度蛋白;制备 apo 态、牛磺石胆酸(TLCA)结合态和脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)结合态的 Ostα/β 复合物样品，采用冷冻电镜单颗粒技术解析其结构，分辨率达 2.6-3.1 Å;通过 [³H]- 牛磺胆酸(TCA)摄取实验验证 Ostα/β 的转运活性及突变体功能;利用免疫荧光、流式细胞术和免疫共沉淀实验分析 Ostα/β 的亚细胞定位、异源二聚体形成及棕榈酰化修饰的影响;通过全细胞膜片钳技术探究 Ostα/β 的电压敏感性和双向转运特性;借助分子动力学模拟分析底物转运路径和关键相互作用;通过点突变实验验证关键残基在底物结合、转运及复合物组装中的作用。

实验结果

图1：人源 Ostα/β 异源二聚体的结构示意图

(a)展示 Ostα/β 的主要生物学功能，包括胆汁酸、类固醇结合物(如 DHEAS)的转运及外源性物质代谢;(b)[³H]-TCA 摄取实验结果显示，Ostα 单独表达时转运活性极低，与 Ostβ 共表达后转运活性显著增强，证实异源二聚体形成对功能至关重要;(c)apo 态 Ostα/β 的冷冻电镜整体结构(contour 水平 0.35)，Ostα 呈深蓝色和浅蓝色，Ostβ 呈深绿色和浅绿色，解析的胆固醇和脂质为灰色，底物结合位点的胆固醇为青色，S - 棕榈酰化密度为黄色;(d)Ostα 的二聚体界面(俯视图);(e)apo 态 Ostα/β 的卡通模型;(f)单个 Ostα/β 原体的卡通模型(Ostα 呈彩虹色，Ostβ 呈灰色);(g)下结合口袋中胆固醇和底物的局部密度图;(h)Ostα/β 的拓扑结构示意图，明确了其独特的结构组成。

图2：Ostα/β 的底物结合凹槽

(a)apo 态 Ostα/β 的静电表面电势图(由 APBS 软件计算);(b-d)分别展示胆固醇(b)、TLCA(c)和 DHEAS(d)结合的关键介导残基，阳性电荷残基 R241 和 R244 与底物的磺酸基团形成特异性静电相互作用;(e)底物结合凹槽附近的二级结构;(f)富含半胱氨酸环的放大图，显示棕榈酰化修饰位点;(g)突变体与野生型 Ostα/β 的 [³H]-TCA 摄取活性对比，TM5/TM6 区域残基(蓝色)和富含半胱氨酸环残基(橙色)的突变显著降低转运活性，证实这些区域对底物结合和转运至关重要。

图3：细胞外侧面的溶剂可及通道

(a-c)TLCA 结合态 Ostα/β 的上通道侧面图(a)、俯视图(b)和放大侧面图(c)，溶剂可及通道用浅绿色圆点标记，关键收缩残基 P209 和 E116 以红色突出显示;(d-f)分别为 apo 态(d)、TLCA 结合态(e)和 DHEAS 结合态(f)Ostα/β 在细胞外通道附近的额外密度图(contour 水平 0.36);(g)胞内空腔突变体与野生型的摄取活性对比，胞内空腔残基突变显著抑制转运活性，表明该通道在底物转运中不可或缺。

图4：Ostα/β 的电压依赖性转运特性

(a)过表达 Ostα/β 的 HEK293T 细胞的全细胞电流 - 电压关系图，DHEAS 处理组(0.1 mM 和 0.3 mM)的电流显著高于溶剂对照组，且电流大小与 DHEAS 浓度相关;(b)典型的全细胞电流轨迹图(同一膜片的不同处理组);(c)Ostα/β 表达组与未转染组在溶剂或 0.3 mM DHEAS 处理下的平均电流值对比，Ostα/β 表达组在 DHEAS 处理后电流显著增加，证实 Ostα/β 介导电压依赖性的 DHEAS 转运，且具有双向转运能力。

图5：介导异源二聚体形成的关键相互作用

(a)Ostα 和 Ostβ N 端之间的疏水相互作用;(b)Ostα/β 环区域的氢键网络;(c)Ostα 与 Ostα' 的二聚体界面;(d)Ostα-Ostα' 二聚体界面的俯视图，磷脂酰乙醇胺样脂质的头部与 R86、E136 和 Y128' 形成氢键;(e)Ostα 与 Ostβ 之间的三个关键相互作用位点;(f)Ostα 和 Ostβ 跨膜区域的疏水相互作用;(g)Ostα-Ostα' 二聚体界面的俯视图;(h)界面突变体对转运活性的影响，关键界面残基突变显著降低 [³H]-TCA 摄取活性，证实这些相互作用对 Ostα/β 的组装和功能至关重要。

研究结论

本研究通过冷冻电镜技术解析了人源 Ostα/β 异源二聚体在 apo 态、TLCA 结合态和 DHEAS 结合态的高分辨率结构，揭示了其独特的膜转运蛋白架构，定义了一个新的转运体家族。Ostα/β 形成对称的异源二聚体四聚体，Ostα 具有全新的七跨膜折叠模式，结合 Ostβ 的单个跨膜螺旋，通过广泛的脂质修饰(包括棕榈酰化富含半胱氨酸基序)稳定结构并形成侧向底物结合凹槽。结构分析发现 Ostα/β 存在两个底物结合位点，通过两亲性螺旋门控通道连接，构成独特的转运路径，该设计在 TMEM184 家族中高度保守，提示一种古老的底物转运机制。电生理研究证实 Ostα/β 是电压敏感的双向转运体，由电化学梯度驱动，与其体内外流功能一致。棕榈酰化修饰不仅参与底物识别，还调控 Ostα/β 的细胞转运和稳定性，脂质 - 蛋白相互作用和蛋白 - 蛋白相互作用共同维持四聚体组装和功能。这些发现阐明了 Ostα/β 的分子机制，为疾病相关突变提供了结构解释，建立了脂质修饰膜转运体的研究范式，同时为代谢性疾病的治疗提供了新的靶点和思路。