基于工程化发光酶 NanoLuc 的新型均相免疫测定法用于真菌毒素伏马菌素 B1 的定量检测

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development of a novel homogeneous immunoassay using the engineered luminescent enzyme NanoLuc for the quantification of the mycotoxin fumonisin B1

中文标题：基于工程化发光酶 NanoLuc 的新型均相免疫测定法用于真菌毒素伏马菌素 B1 的定量检测

发表期刊：《Biosensors and Bioelectronics》

影响因子：10.5

作者单位：

1.Department of Food Science, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, 53706, USA

2.Department of Food Science and Nutrition, King Saud University, Saudi Arabia

3.Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711, USA

4.Promega Biosciences, 277 Granada Drive, San Luis Obispo, CA, 93401, USA

5.Department of Bacteriology, Food Research Institute, University of Wisconsin–Madison, Madison, WI, 53706, USA

6.Department of Systems Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Korea

作者信息：

Tawfiq Alsulami、Nidhi Nath、Rod Flemming、Hui Wang、Wenhui Zhou、Jae-Hyuk Yu*(* 为通讯作者)

研究背景

伏马菌素(Fumonisin)是由镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，其中伏马菌素 B1(FB1)在食品中含量最丰富、毒性最强，被国际癌症研究机构(IARC)归类为 2B 类致癌物，对动物和人类健康构成严重威胁，可导致肝脏、肾脏损伤及食管癌、出生缺陷等疾病。目前检测 FB1 的方法主要包括高效液相色谱(HPLC)等色谱法和酶联免疫吸附试验(ELISA)，但色谱法操作复杂、耗时且需专业人员，ELISA 虽操作简便但属于异相测定，需多次孵育和洗涤步骤，易导致污染且分析时间延长。均相免疫测定法具有操作简单、无需洗涤、可高通量检测等优势，但现有针对 FB1 的均相检测技术灵敏度和适用性不足。基于深海虾荧光素酶改造的工程化发光酶 NanoLuc 具有高亮度、高灵敏度等特点，其双亚基互补系统(NanoBiT)可通过蛋白相互作用重构活性酶并产生发光信号，为开发高灵敏均相免疫测定法提供了理想工具，因此研究人员构建了基于 NanoBiT 的均相发光免疫测定法(FNanoBiT assay)用于 FB1 的快速定量检测。

研究方法

构建基于 NanoBiT 系统的竞争性均相免疫测定体系，将抗伏马菌素单克隆抗体与 NanoLuc 的大亚基(LgBiT)偶联制备 FLgBiT，将 FB1 与 NanoLuc 的小亚基(SmBiT)偶联制备 FSmBiT;优化实验条件，包括 FSmBiT 的稀释溶剂(乙腈 - 水比例)、FSmBiT 与 FLgBiT 的浓度比例及孵育时间，以提升检测灵敏度和稳定性;采用乙腈 - 甲醇 - 水混合溶液提取玉米样品中的 FB1，经稀释过滤后直接用于 FNanoBiT 测定;通过检测不同浓度 FB1 标准品构建校准曲线，确定方法的检测限和动态范围;评估方法的特异性(与黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮等其他真菌毒素的交叉反应)、回收率及相对标准偏差;将该方法用于人工污染和天然污染玉米样品的 FB1 检测，并与 HPLC、超高效液相色谱 - 串联质谱(UPLC/MS/MS)结果进行相关性分析，验证方法的准确性和可靠性。

实验结果

图1：FNanoBiT 测定法的检测原理示意图

(a)展示均相竞争性检测机制：无 FB1 时，FSmBiT 与 FLgBiT 结合重构活性 NanoLuc 酶，氧化底物呋喃嗪(furimazine)产生发光信号;当样品中存在 FB1 时，FB1 与 FSmBiT 竞争结合 FLgBiT，导致发光信号浓度依赖性降低;(b)呈现 NanoLuc 酶亚基氧化底物的反应过程;(c)直观展示 FSmBiT 与 FLgBiT 结合后的发光产生过程，明确了该测定法的核心作用原理。

图2：FLgBiT 与 FSmBiT 的偶联示意图

(a)通过 HaloTag 化学技术将抗伏马菌素抗体与 LgBiT 偶联：先将胺反应性 HaloTag 琥珀酰亚胺酯配体与抗体上的赖氨酸残基结合，再与 HaloTag 融合 LgBiT 孵育形成共价偶联物 FLgBiT;(b)先将 FB1 与马来酰亚胺反应生成 FB1 - 马来酰亚胺复合物，再与 N 端含半胱氨酸的 SmBiT 肽反应，成功制备 FSmBiT 偶联物，为后续检测体系的构建提供了关键材料。

图3：FNanoBiT 测定法的条件优化结果

(a、b)溶剂优化结果显示，50% 乙腈 - 水混合液作为 FSmBiT 稀释溶剂时，发光强度最高，且 FB1 存在时信号差异最显著;(c)对比表明 50% 乙腈 - 水溶剂的发光增强效果优于 7.5%β- 环糊精溶液;(d、e)浓度比例优化显示，当 FLgBiT 浓度为 0.33 nM、FSmBiT 浓度为 10 nM 时，检测灵敏度最优，检测限达 0.079 ng/mL，动态范围为 0.533-6.81 ng/mL;(f)孵育时间优化表明，底物添加后孵育 5 分钟时信号背景比最低，检测准确性最高，且分析时间最短。

图4：FNanoBiT 测定法的特异性验证结果

(a)在 100 ng/mL 浓度下，黄曲霉毒素 B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEA)等其他真菌毒素均未与 FLgBiT 结合，发光信号与空白组无显著差异，无交叉反应;(b、c)该方法对 FB1 的亲和力显著高于结构相似的伏马菌素 B2(FB2)，特异性良好，仅针对 FB1 具有检测活性。

图5：食品基质干扰及阻断效果验证结果

向检测体系中添加不同浓度的非血清蛋白封闭缓冲液(SBB)以抑制玉米提取物的基质干扰，结果显示，添加 1.5% SBB 时可有效阻断 FLgBiT 的非特异性结合，玉米提取物对发光信号的干扰降至最低，确保了复杂样品检测的准确性。

图6：方法相关性与稳定性验证结果

(a)对 20 份人工污染玉米样品的检测结果显示，FNanoBiT 测定法与 HPLC 法的检测结果呈强正相关(r=0.9699)，证实了方法的准确性;(b、c)稳定性实验表明，FLgBiT 和 FSmBiT 溶液在 4℃储存 4 天内，对空白组和 FB1 标准品的检测发光信号稳定，且对玉米样品中 FB1 的检测结果无显著差异，具有良好的短期稳定性。

研究结论

本研究成功开发了基于 NanoBiT 系统的均相发光免疫测定法(FNanoBiT assay)用于 FB1 的定量检测，通过将抗体与 LgBiT 偶联、FB1 与 SmBiT 偶联，构建了竞争性检测体系，优化后检测限达 0.079 ng/mL，动态范围为 0.533-6.81 ng/mL。该方法具有极高的特异性，与其他真菌毒素无交叉反应，在玉米样品检测中回收率高于 94%，相对标准偏差符合要求，且检测结果与 HPLC、UPLC/MS/MS 法具有强相关性。与传统方法相比，FNanoBiT 测定法无需洗涤步骤和二抗，操作简便、分析时间短(仅需 5 分钟孵育)，可实现 FB1 的快速、高灵敏、高通量检测，为食品中 FB1 的污染监控提供了高效可行的技术工具，且该技术平台可扩展至其他食品污染物的检测，具有广泛的应用前景。